姜黄素对豚鼠银屑病样动物模型的药效评价及对增殖细胞核抗原表达的影响

杨正生 李力 王亚斐 杨会君

姜黄素对豚鼠银屑病样动物模型的药效评价及对增殖细胞核抗原表达的影响

杨正生 李力 王亚斐 杨会君

目的 观察姜黄素对豚鼠银屑病样动物模型皮损以及增殖细胞核抗原（PCNA）的影响，探讨姜黄素对银屑病的治疗作用及其机制。方法 将实验豚鼠随机分为6组，每组6只；正常对照组，不进行任何处理，观察3周；银屑病模型组，用5%普萘洛尔乳膏外涂豚鼠耳背，造模3周；造模后观察组，造模后观察2周；造模后对照组，造模后给予25%聚乙二醇溶液灌胃2周，每次1ml，1次/d；低剂量姜黄素组和高剂量姜黄素组，造模后用姜黄素溶液灌胃2周，灌胃量分别为20 mg·kg-1·d-1和40 mg·kg-1·d-1，1次/d。取各组豚鼠耳部标本，HE染色观察豚鼠组织病理学评分的变化，用免疫组化法观察姜黄素对PCNA蛋白表达的影响。结果 豚鼠的皮肤形态观察显示，姜黄素能够缓解豚鼠银屑病样皮肤表现。各组豚鼠组织病理学评分及PCNA蛋白表达阳性率总体比较差异有统计学意义（F=296.14，P<0.01；F=108.49，P<0.01）。两两比较发现，银屑病模型组的组织病理学评分（6.42±0.49）及PCNA表达（63.17%±5.47%）与正常对照组（0.92±0.20，20.83%±2.99%）相比均明显升高（P<0.01）。姜黄素灌胃治疗2周后，低、高剂量组的组织病理学评分（4.25±0.27，1.75±0.42）及PCNA的表达（43.50%±2.90%，25.50%±3.74%）与模型组相比均明显下降，差异均有统计学意义（P<0.01）。结论 姜黄素对豚鼠银屑病样动物模型皮损的病理表现具有改善作用，并能下调PCNA的表达。

银屑病；姜黄素；疾病模型,动物；增殖细胞核抗原；普萘洛尔

因为银屑病的难治性、易复发性以及发病率逐渐增高等原因，其治疗一直受到广泛关注［1］。姜黄素是一种从姜黄、郁金等姜黄属植物的根茎中提取的生物活性物质，具有广泛的生物活性和药理学作用，例如抗增殖、抗炎等，目前被认为可能对很多疾病具有潜在的治疗作用［2］。本实验利用姜黄素灌胃的方法，干预普萘洛尔乳膏外涂诱发的银屑病样豚鼠动物模型，并用HE染色观察组织病理学变化以及采用免疫组化法观察增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA） 的表达变化，以期为姜黄素对银屑病的治疗提供进一步的理论依据。

材料与方法

一、材料及设备

1.动物：健康豚鼠（西安交通大学动物中心提供）雌雄不限，7～9周龄，体重300～350 g，清洁级。在室温下饲养，自由进食及饮水，建立模型后，依据不同组别给予姜黄素灌胃或只加入溶剂灌胃。

2.药物及试剂：姜黄素，美国Sigma公司；小鼠PCNA单克隆抗体（稀释比例1∶50），美国Santa Cruz公司；无水乙醇、多聚甲醛，西安化学试剂厂；多聚赖氨酸即用型链霉素亲和素-生物素复合物（SABC）免疫组化试剂盒、浓缩型二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒，武汉博士德公司。

二、方法

1.实验分组：随机分为6组，每组6只。正常对照组：不进行任何处理，饲养3周后取耳部标本；另5组先参照文献［3］的方法用5%普萘洛尔乳膏外涂豚鼠耳背，每日4次共3周，建立豚鼠银屑病样模型后，各组进行以下处理：银屑病模型组，造模后直接取耳部标本；造模后观察组，造模后不进行任何处理，观察2周后取耳部标本；造模后对照组，造模后给予25%聚乙二醇溶液1ml每日1次灌胃，2周后取耳部标本；低剂量姜黄素组，造模后用25%聚乙二醇溶液配制的姜黄素溶液20 mg·kg-1·d-1每日1次灌胃，给药剂量范围参照文献［4］，2周后取耳部标本；高剂量姜黄素组，造模后用姜黄素溶液40 mg·kg-1·d-1每日1次灌胃，2周后取耳部标本。

2.组织标本HE染色观察：各组经不同方法处理，麻醉后取豚鼠耳部标本，4%甲醛固定后石蜡包埋，HE 染色，光镜下观察，参照 Baker等［5］的皮肤组织病理学评分方法评分：①角质层：角质层中如发现Munro小脓肿，根据严重程度计为1.5～2分，角化过度计0.5分，角化不全计1.0分；②表皮层：颗粒层变薄或消失计1.0分，棘层肥厚计1.0分，皮突延伸呈棒状根据轻、中、重程度计为0.5、1、1.5分；③真皮层：炎性细胞浸润，根据轻、中、重程度计为0.5、1、1.5分，乳突上伸计0.5分，乳突毛细血管扩张计0.5分。

3.免疫组化染色：将切片依次进行脱蜡、脱水等操作步骤；3%H2O2室温条件下处理10min以灭活内源性过氧化物酶；加入山羊血清封闭液孵育15min；加入小鼠抗PCNA单抗4℃孵育10min；加入生物素化羊抗小鼠二抗和SABC孵育；DAB显色。结果判定：PCNA阳性细胞为细胞核着色，有棕黄色的颗粒样物质沉积。选取5个染色均匀的高倍视野，每张切片计数200个细胞中阳性细胞百分比。

4.统计学方法：采用SPSS 13.0软件进行统计分析，计量资料采用±s表示。多组数据的均数比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间比较采用LSD法，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、豚鼠的皮肤形态观察

造模前，豚鼠耳部光滑、平整无脱屑；造模后，模型组豚鼠的耳背皮肤明显增厚，局部红斑，外观粗糙，有部分脱屑等银屑病样皮肤表现。经姜黄素灌胃治疗2周后，银屑病样皮损表现明显减轻，其中红斑、鳞屑及表皮粗糙增厚现象不同程度缓解或消失，以高剂量组的作用更为明显。

二、姜黄素对豚鼠银屑病模型病理学评分的影响

正常豚鼠角质层较薄，颗粒层和棘层细胞层数正常，无皮突向下延伸，基底层为单层细胞，呈柱状；用普萘洛尔乳膏外涂耳背3周后，耳部皮肤可见角化过度，角化不全，颗粒层变薄；棘层细胞明显肥厚，表皮突向下呈棒状延伸，也可见乳突上伸呈杵状以及乳突毛细血管扩张等；部分真皮层可见较明显的炎症细胞浸润。见图1。各组组织病理学评分比较差异有统计学意义，LSD法进行组间比较，银屑病模型组、造模后观察组、造模后对照组均显著高于正常对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）；造模后观察组、造模后对照组与银屑病模型组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；低剂量姜黄素组、高剂量姜黄素组与银屑病模型组、造模后观察组、造模后对照组比较均明显下降，差异有统计学意义（P＜0.01），且高剂量组评分下降更为明显。见表1。

图1 姜黄素对豚鼠银屑病模型病理学形态的影响（HE×200） 1A：正常对照组；1B：银屑病模型组；1C：造模后观察组；1D：造模后对照组；1E：低剂量姜黄素组；1F：高剂量姜黄素组。正常对照组组织形态学无明显异常，银屑病模型组出现了典型的银屑病样病理改变，药物干预后组织银屑病样病理改变减轻

图2 姜黄素对豚鼠银屑病模型增殖细胞核抗原（PCNA）表达的影响（免疫组化×200） 2A：正常对照组；2B：银屑病模型组；2C：造模后观察组；2D：造模后对照组；2E：低剂量姜黄素组；2F：高剂量姜黄素组。正常对照组PCNA呈低表达，银屑病模型组表达明显升高，姜黄素干预后PCNA表达明显下降

表1 姜黄素对豚鼠银屑病模型组织病理学评分及增殖细胞核抗原（PCNA）表达的影响（±s）

表1 姜黄素对豚鼠银屑病模型组织病理学评分及增殖细胞核抗原（PCNA）表达的影响（±s）

组别 只数 组织病理学评分PCNA蛋白表达阳性率（%）正常对照组 6 0.92±0.20 20.83±2.99银屑病模型组 6 6.42±0.49 63.17±5.47造模后观察组 6 6.17±0.26 62.00±4.85造模后对照组 6 6.00±0.32 60.17±5.96低剂量姜黄素组 6 4.25±0.27 43.50±2.90高剂量姜黄素组 6 1.75±0.42 25.50±3.74 F值 296.14 108.49 P值 ＜0.01 ＜0.01

三、姜黄素对豚鼠银屑病模型PCNA表达的影响

经免疫组化SABC法检测，各组豚鼠PCNA蛋白表达阳性率差异有统计学意义。正常对照组豚鼠皮肤PCNA表达较低，主要集中在基底层细胞，而银屑病模型组PCNA表达明显增多，且分布更为广泛，两组PCNA表达阳性率差异有统计学意义（P＜0.01）。造模后观察组和造模后对照组与正常对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.01），与银屑病模型组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。而低剂量、高剂量的姜黄素均能降低PCNA的表达，两组PCNA表达阳性率分别与模型组、造模后观察组、造模后对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.01），而高浓度姜黄素组降低更为明显。见图2、表1。

讨 论

银屑病的发生和持续与免疫细胞的功能异常导致皮肤角质形成细胞（keratinocyte，KC）的异常增殖和分化有关。我们参照文献［3］以5%普萘洛尔乳剂外涂3周成功制备了具有银屑病样皮损的动物模型，并观察姜黄素灌胃对豚鼠银屑病样皮损的影响。结果显示，普萘洛尔造模后豚鼠皮肤的组织病理学评分明显升高，而姜黄素灌胃治疗后，组织病理学评分明显下降，说明姜黄素能够明显降低造模引起的皮肤银屑病样炎症反应。另外，普萘洛尔造模后豚鼠皮肤PCNA表达较正常对照组明显升高，而姜黄素灌胃治疗后，PCNA表达明显下降。以上结果表明，姜黄素能够下调豚鼠银屑病样炎症反应以及KC的异常增殖效应，进一步明确了姜黄素对银屑病可能存在一定的治疗作用。

普萘洛尔乳膏外涂制备银屑病动物模型已应用了数十年，得到了广泛认可。虽然它并不能全面反映人银屑病的病理特点，但作为一种简便高效的动物模型，在抗银屑病药物的筛选中具有一定的优势［6］。PCNA是一种能够比较可靠反映细胞增殖情况的指标，目前认为其高表达与KC的异常增殖有密切关系，并且在银屑病患者皮损中存在高表达现象［7］，因此PCNA也常作为抗银屑病药物筛选中疗效鉴定的指标。

目前很多针对银屑病的靶向治疗药物在长期应用的情况下会出现明显的不良反应。姜黄素是提取自姜黄属植物根茎中的一种多酚类物质，曾作为食品添加剂被广泛应用，也曾作为一种传统药物用于很多疾病的治疗。目前的研究表明，姜黄素具有较强的抗炎［8］、抗氧化［9］、抗细胞异常增殖、抗肿瘤［10］的功效，其生物学和药理学功效非常广泛［11］。也有很多研究表明，姜黄素可能存在潜在的抗银屑病功效。Bosman［12］发现，局部外用姜黄素能够对银屑病小鼠尾部的细胞增殖取得良好的抑制效果。但作为一种植物提取的有效成分，目前姜黄素的系统给药也在很多疾病的治疗研究中得到了广泛应用。姜黄素能够抑制银屑病患者KC的角化不全现象、转铁蛋白受体的表达以及表皮CD8+T细胞的表达［13-14］。也有学者［13］对临床、组织学、免疫组化等结果进行参数分析，发现姜黄素对磷酸化酶激酶活性的抑制作用与银屑病治疗之间存在一定的关系。杨晓红等［15］报道，姜黄素能够激发肿瘤坏死因子α对HaCaT细胞的促凋亡作用，抑制肿瘤坏死因子α对HaCaT细胞的促增殖作用。

我们的动物实验结果进一步支持姜黄素可能具有抗银屑病作用的理论推测，但在动物模型上还存在一定的局限性。今后还需建立更为理想的动物模型或大样本的临床试验来证明以上推测，并在其治疗的具体机制方面进行更加深入细致的探讨。

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2014-03-27）

（本文编辑：周良佳 颜艳）

Curcumin for propranolol-induced psoriasis-like lesions in guinea pigs:evaluation of therapeutic efficacy and effects on proliferating cell nuclear antigen expression

Yang Zhengsheng*,Li Li,Wang Yafei,Yang Huijun.*Department of Dermatology,First Hospital of Qinhuangdao,Qinhuangdao 066000,Hebei,China

Yang Zhengsheng,Email:ylxd785@126.com

ObjectiveTo estimate the influence of curcumin on psoriasis-like lesions and proliferating cell nuclear antigen（PCNA）expression in guinea pigs,so as to investigate the therapeutic effect and mechanism of curcumin in psoriasis.MethodsA model of psoriasis-like skin inflammation was established by applying propranolol 5%cream（4 times a day for 3 weeks）to the dorsal skin of ears of 30 guinea pigs,which were then equally classified into 5 groups:model group receiving no treatment,observation group receiving no treatment but observation for 2 weeks,model control group treated with intragastric 25%polyethylene glycol solution （1ml once a day）for 2 weeks,low-dose and high-dose curcumin groups treated with intragastric curcumin solution at 20 and 40 mg/kg per day respectively once a day for 2 weeks.Six guinea pigs receiving neither induction by propranolol nor treatment by curcumin or polyethylene glycol solution served as the normal control group.Skin specimens were harvested from the ears of guinea pigs in the normal control group after three weeks of breeding,in the model group immediately after the establishment of psoriasis-like model,in the observation group after 2 weeks of observation,and in the other 3 groups after 2 weeks of treatment.Subsequently,haematoxylin-eosin （HE） staining wasconducted to observe histopathologic changes,and immunohistochemical assay to detect the expression of proliferating cell nuclear antigen （PCNA）.ResultsGross observation of the skin revealed that curcumin attenuated psoriasis-like skin manifestations in guinea pigs.There were significant differences in histopathologic scores（F=296.14,P<0.01）and PCNA expression rate among the 6 groups（F=108.49,P<0.01）.Least significant difference （LSD）test showed that both histopathologic scores and PCNA expression rate were significantly higher in the model group than in the normal control group（6.42±0.49 vs.0.92±0.20,63.17%±5.47%vs.20.83%±2.99%,bothP<0.01）.After 2 weeks of treatment,both low-dose and high-dose curcumin groups showed significantly lower histopathologic scores（4.25±0.27 and 1.75±0.42 vs.6.42±0.49,bothP<0.01）and PCNA expression rate（43.50%±2.90%and 25.50%±3.74%vs.63.17%±5.47%,bothP<0.01）compared with the model group.ConclusionCurcumin can attenuate pathological manifestations of psoriasis-like lesions,and downregulate PCNA expression in guinea pigs.

Psoriasis;Curcumin;Disease models,animal;Proliferating cell nuclear antigen;Propranolol

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.03.008

秦皇岛市科学技术研究与发展项目（2102023A131）

066000河北，秦皇岛市第一医院皮肤科（杨正生、王亚斐、杨会君），肾内科（李力）

杨正生，Email：ylxd785@126.com