HPLC法测定抗毒合剂中绿原酸的含量

邓松岳王迎举

（1河南省商丘市食品药品检验所，商丘476000；2河南省药品审评认证中心，郑州450004）

HPLC法测定抗毒合剂中绿原酸的含量

邓松岳1王迎举2

（1河南省商丘市食品药品检验所，商丘476000；2河南省药品审评认证中心，郑州450004）

目的建立抗毒合剂中绿原酸的含量测定方法。方法采用高效液相色谱法，色谱条件为：色谱柱：ZORBAX SBC18；流动相：乙腈-0.4%磷酸溶液（15∶85）；流速：0.8 ml·min-1；检测波长：327 nm。结果绿原酸在0.0904～0.904 μg范围内线性关系良好（r=1.0000），平均回收率为98.29%，RSD=1.06%（n=6）。结论本方法操作简便，专属性强，结果准确，可用于抗毒合剂的质量控制。

绿原酸；高效液相色谱法；抗毒合剂

抗毒合剂（豫药制字Z20120594（郑）），是由金银花、大青叶、板蓝根、连翘、柴胡、葛根六味药材加工制成的复方制剂，具有清热凉血、解毒消肿之功效，主治各种感冒、发热、病毒性腮腺炎、扁桃体炎、咽炎及急性支气管炎。方中君药金银花，又名忍冬（学名：Lonicera japonica）。“金银花”一名出自《本草纲目》，由于忍冬花初开为白色，后转为黄色，因此得名金银花。药材金银花为忍冬科植物忍冬干燥花蕾或带初开的花，自古被誉为清热解毒的良药。它性甘寒气芳香，甘寒清热而不伤胃，芳香透达又可祛邪。金银花既能宣散风热，还善清解血毒，用于各种热性病，如身热、发疹、发斑、热毒疮痈、咽喉肿痛等症，均效果显著。金银花自古以来就以它的药用价值广泛而著名。其功效主要是清热解毒，主治温病发热、热毒血痢、痈疽疔毒等。现代研究证明，金银花含有绿原酸、木犀草素苷等药理活性成分，对溶血性链球菌、金黄葡萄球菌等多种致病菌及上呼吸道感染致病病毒等有较强的抑制力，另外还可增强免疫力、抗早孕、护肝、抗肿瘤、消炎、解热、止血（凝血）、抑制肠道吸收胆固醇等，其临床用途非常广泛，可与其它药物配伍用于治疗呼吸道感染、菌痢、急性泌尿系统感染、高血压等40余种病症。

金银花性寒，味甘，入肺、心、胃经，具有清热解毒、抗炎、补虚疗风的功效，主治胀满下疾、温病发热，热毒痈疡和肿瘤等症。其对于头昏头晕、口干作渴、多汗烦闷、肠炎、菌痢、麻疹、肺炎、乙脑、流脑、急性乳腺炎、败血症、阑尾炎、皮肤感染、痈疽疔疮、丹毒、腮腺炎、化脓性扁桃体炎等病症均有一定疗效。

金银花药用价值和保健用途广泛，社会需求量大。金银花的成色不同，药用效果也不同。因此控制制剂中金银花品质的优劣，是关系到制剂功效的关键所在。但抗毒合剂现行质量标准无含量测定项目，无法从定量的角度控制药品质量，确保该制剂的疗效，本文以方中君药金银花的有效成分绿原酸为指标成分［1］，建立了抗毒合剂中绿原酸的高效液相测定方法，该方法操作简便，省时，准确，可作为抗毒合剂的质量控制方法。

在进行质量研究的过程中，一项重要的工作就是要对质量标准中所涉及到的分析方法进行方法学验证，以保证所用的分析方法确实能够用于在研药品的质量控制。本文按照《中国药典》2010年版附录方法学验证指导原则中要求的项目进行试验验证，结果满意。

1 仪器与试药

Agilent 1260型高效液相色谱仪，AUW-220D电子分析天平，5210DT超声处理器；绿原酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110753-200413）；乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂为分析纯。抗毒合剂（河南省人民医院）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱：ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 um）

流动相：乙腈-0.4%磷酸溶液（15∶85）为流动相；流速0.8 ml·min-1；检测波长327 nm；进样量10 μl。

2.2 线性关系考察线性关系指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。应在规定的范围内测定线性关系。可用一贮备液经精密稀释，或分别精密称样，制备一系列供试样品的方法进行测定，至少制备5份供试样品。以测得的响应信号作为被测物浓度的函数作图，观察是否呈线性，再用最小二乘法进行线性回归。必要时，响应信号可经数学转换，再进行线性回归计算。

取绿原酸对照品约10 mg，精密称定，置50 ml量瓶中，加50%甲醇适量，振摇使完全溶解后，稀释至刻度，摇匀，精密量取2 ml置10 ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀。按照“2.1”项色谱条件，分别进样2、4、6、8、10、14、16、20 μl，记录绿原酸峰面积值，以峰面积积分值（Y）对对照品进样量（X）进行线性回归，得回归方程：Y=3492.1X-2.2747，r=1.0000。结果表明，绿原酸对照品进样量在0.0904～0.904 μg范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.3 对照品溶液的制备取绿原酸对照品约10 mg，精密称定，置50 ml量瓶中，加50%甲醇适量，振摇使完全溶解后，稀释至刻度，摇匀，精密量取2 ml，置10 ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2.4 供试品溶液及阴性对照溶液的制备精密量取本品2 ml，置10 ml量瓶中，加入50%甲醇适量，超声处理30分钟（功率250 W，频率35 KHZ），放冷，加50%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。另取缺金银花的其他味药按处方工艺制成阴性制剂，按上述方法制备阴性对照溶液。

图1 高效液相色谱图

2.5 干扰试验取上述3种溶液，按照上述色谱条件，分别注入高效液相色谱仪，进样测定，记录色谱图，结果表明供试品溶液在与对照品溶液色谱相应的位置上，有相应的色谱峰，而阴性对照溶液在此保留时间无干扰。色谱图见图1。

2.6 精密度试验精密度系指在规定的测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。

取同一供试品溶液，重复进样5次，每次10 μl，记录峰面积，RSD=0.99%（n=5），表明精密度良好。

2.7 稳定性试验按照分析方法分别配置供试品溶液，按照一定的时间间隔测定主成分的含量，计算相对标准偏差。

取同一供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10 h进样测定，RSD=0.97%，供试品溶液在10小时内峰面积基本稳定。

2.8 加样回收率试验准确度系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般以回收率（%）表示。准确度应在规定的范围内建立。本文采用加样回收率试验，具体操作如下：

精密量取已知含量的供试品（含量为0.1963 mg/ ml）1.00 ml，6份，分别置10 ml量瓶中，另分别精密加入对照品溶液（浓度为0.2011 mg/ml）1.00 ml，制备成供试品溶液，分别测定绿原酸的含量，见表1。

表1 加样回收率试验结果

2.8 样品测定取3批样品，按“2.4”项下方法制备供试液，各进样10 μl，按外标法计算绿原酸的含量，结果见表2。

表2 3批样品中绿原酸的含量

3 讨论

绿原酸是金银花的有效成分之一，也是金银花的主要抗菌、抗病毒有效药理成分之一。绿原酸具有较广泛的抗菌作用，但在体内能被蛋白质灭活。与咖啡酸相似，口服或腹腔注射时，可提高大鼠的中枢兴奋性；可增加大鼠及小鼠的小肠蠕动和大鼠子宫的张力，有利胆作用，能增进大鼠的胆汁分泌，对人有致敏作用，吸入含有本品的植物尘埃后，可发生气喘、皮炎等。本文采用高效液相色谱法对绿原酸进行含量测定，绿原酸的紫外吸收图谱显示，其在327 nm波长处有最大吸收，故选择327 nm为测定波长。

本文参考有关文献［2-4］，供试品的制备分别采用回流0.5 h、1 h、2 h提取，超声10 min、30 min、1 h提取，试验结果表明超声处理30 min提取较为完全，且操作简便快捷，故采用超声提取30 min。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典·一部［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：205.

［2］郭凡岭，申凤菊，申海荣.HPLC法测定复方罗布麻片中绿原酸和蒙花苷的含量［J］.中国药事.2010.24（5）：444-446.

［3］余卫兵，毕雪艳，张钢平，等.HPLC法测定臁疮丸中绿原酸的含量［J］.中国药师，2007，10（12）：1270-1271.

［4］李泽玲，付瑛，陈雅宁.HPLC法同时测定茵栀黄分散片中绿原酸与栀子苷的含量［J］.亚太传统医药，2013，9（6）：42-44.

识别真假木瓜

木瓜又名皱皮木瓜、铁脚梨，为蔷薇科植物贴梗海棠的成熟干燥果实，载入《名医别录》，《本草纲目》中李时珍引宋代药物学家苏颂语：“木瓜处处有之，而宣城者为佳，木状如柰。春末开花，深红色。其实大者如瓜，小者如拳，上黄似着粉。”每年9～10月采收成熟的果实，置沸水中煮5～10分钟后捞出，晒至外皮起皱时，纵剖为2或4块，再晒至颜色变红为度。若白天日晒，晚间夜露经霜，则颜色更加鲜艳。

木瓜性温，味酸，入肝、脾经，具有平肝和胃、去湿舒筋的功效，用于治疗吐泻转筋、湿痹、脚气、水肿、痢疾等症。《本草正》载：“木瓜，用此者用其酸敛，酸能走筋，敛能固脱，得木味之正，故尤专入肝益筋走血。疗腰膝无力，脚气，引经所不可缺，气滞能和，气脱能固。以能平胃，故除呕逆、霍乱转筋，降痰，去湿，行水。以其酸收，故可敛肺禁痢，止烦满，止渴。”市场上有以同科植物榠楂冒充木瓜。苏颂曾曰：“榠楂木叶花实酷类木瓜，但比木瓜大而黄色，辨之惟看蒂间，别有重蒂如乳者为木瓜，无此则榠楂也。”此榠楂即为光皮木瓜，使用时注意鉴别。

真品木瓜干燥果实呈长圆形，常纵剖为卵状半球形，长4～8厘米，宽3．5～5厘米，厚2～8毫米，外皮棕红色或紫红色，微有光泽，常有皱褶，边缘向内卷曲；质坚硬，剖开面呈棕红色，平坦或有凹陷的子房室，种子大多数脱落，有时可见子房隔壁；种子三角形，红棕色，内含白色种仁1粒；闻之气微，口尝味酸涩。

伪品榠楂干燥果实呈月牙形或类长椭圆形，多纵剖成2～4瓣，表面平滑或稍粗糙无皱褶，有极细的皱纹，呈红棕色，光滑无皱纹，久存后为紫棕色，两端平或微翘，边缘微内曲，剖面平坦或微凹；果肉较厚，呈红棕色，粗糙，显颗粒性；中心子房室明显，内含种子多数，种子扁平三角形，排列紧密，为红棕色；质坚硬而重，闻之气微香，口尝味酸涩，嚼之有砂粒感。伪品榠楂虽与木瓜为同科植物，但不具备木瓜的各项功效，从理化鉴定的各项指标看，与真品木瓜也有较大的差异，故《中国药典》1985年版开始仅收载蔷薇科植物皱皮木瓜一种，弃去同科属植物榠楂，不作木瓜药用，临床用药必须仔细鉴别。

——摘自《中国中医药报》

Determination of Chlorogenic Acid in Antitoxic Mixture by HPLC

DENG Songyue1，WANG Yingju2
（1 Shangqiu Institute of Food and Drug Inspection，Henan Province Shangqiu476000，China；2 Drug Approval Certification Center of Henan Province，Zhengzhou 450004，China）

Objective To set up a method to determination of chlorogenic acid in antitoxic mixture.Methods The content of chlorogenic acid determined by HPLC.The chromatographic system consisted of C18 column，using acetonitrile-0.4%phosphate solution（15∶85）as mobile phase.The content was detected at a waveleng of 327 nm，the flow rate was 0.8 ml·min-1.Results The chlorogenic acid have a good tincar rolatim in the range of 0.0904～0.904 ug（r=1.0000），the average recovery was 98.29%and RSD=1.06%（n=6）.Conolusion The established method is simple，sensitive and accuracy.It can be used for quality control of antitoxic mixture.

chlorogenic acid；HPLC；antitoxic mixture

10.3969/j.issn.1672-2779.2015.09.066

1672-2779（2015）-09-0131-03

：张文娟本文校对：王正波

2015-03-20）