健骨伸筋汤对大鼠膝关节炎关节软骨病理改变及关节液IL-1β及NO含量的影响※

刘洪波靖春颖*谢毅强韩平

（1海南医学院中医学院，海口571199；2海南医学院科研处，海口571199；3海南医学院附属医院中医科，海口570102）

健骨伸筋汤对大鼠膝关节炎关节软骨病理改变及关节液IL-1β及NO含量的影响※

刘洪波1靖春颖1*谢毅强2韩平3

（1海南医学院中医学院，海口571199；2海南医学院科研处，海口571199；3海南医学院附属医院中医科，海口570102）

目的观察健骨伸筋汤对大鼠膝关节炎关节软骨病理改变及关节液IL-1β及NO含量的影响。方法45只雌性SD大鼠随机分为5组，每组9只。通过改良的Hulth法制成肾虚型大鼠的膝骨性关节炎模型，2周后，对空白对照组、模型组生理盐水灌胃；治疗组分低、高浓度进行中药灌胃，于灌胃后第7周、13周各组随机挑选一半观察大鼠膝关节炎关节软骨病理改变及关节液IL-1β及NO含量的变化。结果造模后大鼠膝关节软骨评分远高于空白对照组，软骨破坏严重，差异有统计学意义（P＜0. 01）；经治疗后，评分均有所降低，IL-1β和NO含量有所改善，说明治疗对膝关节软骨有修复作用，健骨伸筋汤低剂量组、高剂量组与壮骨关节丸组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论健骨伸筋汤可降低IL-1β和NO含量，有一定的关节软骨保护作用，可一定程度地延缓膝骨关节炎动物模型软骨的退变。

健骨伸筋汤；膝关节炎；软骨修复

健骨伸筋汤是治疗膝骨关节炎（Knee Osteoarthritis，KOA）的经验方，经长期的临床运用及观察发现，健骨伸筋汤可减缓骨性关节炎发展［1］。本实验采用复制KOA实验动物模型的方法，从观察关节软骨病理改变及关节液IL-1β及NO含量等指标的角度入手，深入研究健骨伸筋汤治疗KOA的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物45只雌性健康4月龄SD大鼠，空腹体质量120～150 g，购自长沙市天勤生物技术有限公司（许可证号：SCXK（湘）2009-0012），为SPF级动物。

1.1.2 实验药品及试剂健骨伸筋汤：由海南医学院药学院制备，按人与动物体表面积折算等效计量比值折算成大鼠生药量。浓缩含生药2 g/ml，4℃保存。IL-1β酶联免疫分析试剂盒和NO试剂盒（硝酸还原酶法）购自海南绿叶生物制药有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组45只雌性SD大鼠随机分为5组，每组9只：A组（空白对照组）、B组（造模组）、C组（壮骨关节丸组）、D组（健骨伸筋汤低剂量组）、E组（健骨伸筋汤高剂量组）。

1.2.2 造模方法通过改良的Hulth法［2］（取背侧切口切除双侧卵巢，再按照Hulth法：将大鼠麻醉后，仰卧于手术台上，无菌条件下取膝关节内侧纵切口长约2 cm，显露膝关节，然后切断前后交叉韧带及内侧副韧带，完整切除内侧半月板，注意勿损伤关节软骨面。）制成肾虚型大鼠的膝骨性关节炎模型。术毕无菌敷料包扎，不固定伤肢。术后每天每只大鼠肌肉注射青霉素20万U，共1 w。术后每天强迫大鼠活动30 min。2周后随机处死造模成功的1只大鼠，切取双侧股骨髁软骨处理后，电镜下观察，证实造模成功，而后进入实验研究。

1.2.3 给药方法及病理标本选取建立大鼠的膝骨性关节炎模型，2 w后，开始对空白对照组、模型组生理盐水灌胃；治疗组分低、高浓度进行中药灌胃（中药方剂：骨碎补、鹿衔草、丹参、牛膝、薏苡仁、五加皮、穿山龙）。对照组：壮骨关节丸；大鼠剂量（mg/ kg）=系数（6.25）×人的剂量（mg/kg）。

于灌胃后第7周、13周各组随机挑选一半，取大鼠关节滑液0.3-1 mL，用冻存管-4℃普通冰箱，取材结束后将所有采集的滑液标本置于-70℃冰箱冻存备用，标本于1周内进行IL-1β、NO含量的测定。对膝关节进行大体观察，然后用空气栓塞法处死行大体解剖学观察，并用10倍手术显微镜观察软骨表面，参照关节镜对OA的分度方法，对软骨表面情况进行分级。

用线锯将股骨髁完整取下，清除软组织，用生理盐水荡洗2遍，置入10%的中性缓冲福尔马林中固定48h后，在室温下用10%的EDTA脱钙液脱钙15天左右，将所有标本石蜡包埋并切片，分别行HE、S/F染色，参照改良Mankin法进行评分［3］。

1.2.4 统计学方法采用SPSS17.0软件进行统计分析，计量资料以（x±s）表示，组间差异显著性检验采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

大体标本观察：按软骨损伤分级法将软骨退变程度分为：0级正常；Ⅰ级关节软骨变为黄白色，光泽差，表面仍较平滑；Ⅱ级在Ⅰ级的基础上出现溃疡改变，溃疡未及全层；Ⅲ级软骨全层破坏，软骨下骨暴露。模型组（B）关节磨损程度远高于空白对照组（A），表明造模成功，经过治疗壮骨关节丸组（C）、低剂量组（D）、高剂量组（E）关节软骨形态均有所改善，优于模型组，见表1。

表1 各组软骨组织损伤分级

光学显微镜（OM）观察：将取出的股骨髁软骨标本行常规固定，脱钙，石蜡包埋，切片，HE染色，在光学显微镜（OM）下观察。依据改良Mankin法中的结构、细胞以及潮线的完整性进行OA评分，见表2。

表2 各组大鼠膝关节切片Mankin评分比较（x±s）

以上表明，造模后大鼠膝关节软骨评分远高于空白对照组，软骨破坏严重，差异有统计学意义（P＜0.01）；经治疗后，评分均有所降低，说明治疗对膝关节软骨有修复作用，健骨伸筋汤低剂量组、高剂量组与壮骨关节丸组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。

IL-1β、NO含量的测定，见表3，表4。

表3 IL-1β的PU值比较（x±s）

以上表明：模型组IL-1β的PU值较空白对照组高（P＜0.01），壮骨关节丸组较模型组降低，但较低剂量、高剂量组高（P＜0.01）。结果提示在降低软骨IL-1β表达上高剂量组效果最明显，低剂量组次之，均优于对照组（壮骨关节组）。

表4 各组大鼠血清中NO的含量测定对比（x±s）

以上表明：模型组与空白对照组比较，模型对照组血清中NO含量显著升高（P＜0.01）。低剂量组、高剂量组与模型对照组比较，NO含量显著下降（P＜0.01）。结果提示在降低软骨NO含量表达上高剂量组效果最明显，低剂量组次之，均优于对照组（壮骨关节组）。

3 讨论

骨关节炎属中医“痹症”范畴，多以肝肾不足为本，气滞血瘀为标。健骨伸筋汤选用补肾壮骨、活血化瘀的中药组方而成，健骨伸筋汤（鹿衔草、骨碎补、丹参、牛膝、薏苡仁、五加皮、穿山龙）的临床疗效已有观察，方中鹿衔草味甘、苦、性温，入肝、肾二经，补虚益肾，祛风除湿。骨碎补，味苦，性温，归肝肾经，补肾、活血、止血、续伤。方中丹参、牛膝为臣，二药均为活血化瘀见长合而用之，相得益彰，共凑活血通络之效。穿山龙、薏苡仁、五加皮三药为佐，共助君药祛风除湿蠲痹之力，兼以柔筋之效。诸药合用，益肾壮骨以扶正，祛湿活络以祛邪，标本同治。本实验表明健骨伸筋汤可降低IL-1β和NO含量，提示其疗效机理可能在于调节细胞因子的异常活动，从而促进损伤关节软骨的修复［4-5］。健骨伸筋汤在低、高剂量均有一定的关节软骨保护作用，可一定程度地延缓膝骨关节炎动物模型软骨的退变。

综上所述，说明健骨伸筋汤能够促进软骨修复，并显著降低了IL-1β的表达。证实了健骨伸筋汤作用持久，副作用小，也提示骨关节炎软骨损伤可能与IL-1β异常高表达有关，防治作用可能是通过抑制IL-1β的分泌而实现的，这与前人研究结论一致［6］。同时，健骨伸筋汤提高机体抗氧化能力，改善局部微循环，促进炎性物质的吸收，清除过多的超氧自由基从而避免超氧自由基及其代谢产物对机体的损伤，抑制炎症因子NO的过量释放［7］，从而保护了软骨细胞，延缓了关节软骨退变的进展。但治疗最佳作用的用量是多少，对骨细胞如何调节还有待进一步研究。

［1］齐伟，郝东明.健骨伸筋汤治疗膝骨关节炎的临床观察［J］.长春中医学院学报，2003，19（2）:25.

［2］于娟，李莎莎，叶莹仪，等.补肾活血方对兔膝骨性关节炎的治疗作用研究［J］.中国实验方剂学杂志，2014，20（6）:171-174.

［3］周军，刘晓海，宋亚玲，等.抗骨增生胶囊对大鼠骨性关节炎的实验研究［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18（19）:145.

［4］钱春美，袁秀荣，文小平，等.芍药舒筋片对大鼠膝骨关节炎软骨病理及COMP水平的影响［J］.上海中医药杂志，2013，47（3）：76-78.

［5］Hongbin Wu，Jingyuan Du，Qixin Zheng.Expressionof MMP-1 in cartilage and synovium of experimen-tally induced rabbit ACLT traumatic osteoarthritis:immunohistochemical study［J］.Rheumatol Int，2008，29:31-36．

［6］黄剑，卓廉士，彭支莲，等.电针对家兔膝骨关节炎模型关节液中IL-1、IL-6和TNF-a的影响［J］.中国中医骨伤科杂志，2007，15（3）:17.

［7］葛鸿庆，薄智云.腹针疗法对膝骨性关节炎实验动物模型血清TNF-α及IL-1水平的影响［J］.新中医，2014，46（8）：178-179.

Effects of Jiangu Shenjin Decoction on Changes of the Cartilage and IL-1Β，NO of Knee Osteoarthritis of Rats

LIU Hongbo1，JING Chunying＊1，XIE Yiqiang2，HAN Ping3
（1 TCM College，Hainan Medical University，Haikou 571199，China；2 Scientific Research Office，Hainan Medical University，Haikou 571199，China；3 Deparment of TCM，Affiliated Hospital of Hainan Medical University，Haikou 570102，China）

Objective To explore the effects of Jiangu Shenjin decoction in changes of the cartilage and IL-1β，NO of knee osteoarthritis of rats.Methods:KOA experimental animal mode was applied in this experiment，45 female SD rats were randomly divided into 5 groups，9 rats in each group.Rats were got knee osteoarthritis by hulth.Two weeks later，the nomal group and model group were fed Physiological saline.The treatment groups of low concentration Jiangu Shenjin decoction and high concentration Jiangu Shenjin decoction were fed low or high concentration Jiangu Shenjin decoction.Observing the changes of the cartilage and IL-1β，NO of knee osteoarthritis of rats in seven week and thirteen week.Results The changes of the cartilage of the rats by hulth was worse obvious than that of the normal rats，the difference was statistically significant（P＜0.05）.After treatment，the changes of the cartilage and IL-1β，NO were improved.It proved that cartilage of osteoarthritis rats was repaired.Groups of low concentration Jiangu Shenjin decoction and high concentration Jiangu Shenjin decoction were better than those of the the matched group，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion Jiangu Shenjin decoction can decrease the content of the IL-1β，NO，and protect cartilage of knees and put off the degeneration of cartilage.

Jiangu Shenjin decoction；knee osteoarthritis；cartilage repair

10.3969/j.issn.1672-2779.2015.09.065

1672-2779（2015）-09-0129-03

：苏玲本文校对：冯志成

2015-04-09）

海南省教育厅科研项目（No：Hjkj2011-29）

*通讯作者：jcy_ok@126.com