硬叶斯垂科特组培快繁体系的建立

史俊 席刚俊 徐超 徐晓燕

摘要：采用未成熟种子作为外植体，研究了硬叶斯垂科特（Tillandsia stricta Rigid）的组培快繁方法。结果表明，种子萌发的最佳培养基为1/2MS+1.0 mg/L IAA+80 g/L土豆汁+25 g/L蔗糖+6 g/L琼脂，40 d后，种子萌发率达89%；增殖培养基为1/2MS+1.0 mg/L IAA + 0.2 mg/L 6-BA+80 g/L土豆汁+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂，50 d后的增殖率达2.03；生根培养40 d后的小苗高1 cm左右，移栽成活率可达95%以上。

关键词：硬叶斯垂科特（Tillandsia stricta Rigid）；培养基；增殖；快繁体系

中图分类号：Q943.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）21-5429-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.21.058

Establishing of Tissue Culture Rapid Propagation System of Tillandsia stricta Rigid

SHI Jun，XI Gang-jun，XU Chao，XU Xiao-yan

（Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry，Jurong 212400，Jiangsu，China）

Abstract： The immature seeds were used as explants to research methods of tissue culture system from Tillandsia stricta Rigid. The results showed that the best media for seed germination was 1/2MS+1.0 mg/L IAA+80 g/L potato juice+25 g/L sucrose+6 g/L agar， seed germination rate reached 89% T. stricta from A2 medium formula after 40 days； and proliferation medium was 1/2MS+1.0 mg/L IAA+0.2 mg/L 6-BA+80 g/L potato juice+30 g/L sucrose+6 g/L agar，the proliferation rate was 2.03 after 50 days. Seedlings height was about 1 cm in rooting culture after 40 days， the transplanting survival rate may reach above 95%.

Key words： Tillandsia stricta Rigid；medium；proliferation；rapid propagation system

室内空气污染是目前国内外迫切需要解决的环境问题，现代城市居民80%的时间在家庭居室、办公室、公共建筑等环境中渡过，由于通风不良及现代建筑材料、装饰材料、家具办公用品（特别是新装修后不久的房屋）不断释放甲醛、苯、甲苯等有害物质，人体健康受到严重危害。铁兰属（Tillandsia）植物是凤梨科（Bromeliaceae）中的耐旱气生种类，为多年生附生或气生草本植物，可生长在空气中，无需泥土花盆、抗逆性强，属于景天酸植物（CAM）[1，2]，夜间吸收CO2，增加了局部环境的氧气浓度，而且还可以吸收居室内甲醛、苯等有毒有害物质，净化居室空气[3-6]，有利于人们的身心健康。

硬叶斯垂科特（Tillandsia stricta Rigid）是我国引进的铁兰属植物中应用较为广泛的一种，为单生硬叶型，叶片绿色。花苞片粉红色，花大，花形美观，花期长[7]可制作成花球，市场应用前景巨大。但是斯垂科特生长缓慢，繁殖不易，主要的繁殖方式为种子繁殖和分株繁殖[8]，但这2种繁殖方式的繁殖速度缓慢。本研究的目的是利用硬叶斯垂科特未成熟的种子作为外植体材料，建立起斯垂科特的组培快繁体系，加快了硬叶斯垂科特的繁殖速度，为解决其应用瓶颈提供支持。

1 材料与方法

1.1 材料来源

2011年7月，在江苏农林职业技术江苏农博园的智能温室[（26±2） ℃，RH80%]中对硬叶斯垂科特进行人工授粉，10月底取未完全成熟的果荚作为试验材料。

1.2 方法

1.2.1 外植体消毒 将取回的、未完全成熟的果荚用去污剂清洗干净，再用自来水冲洗10 min，在超净工作台上，用75%乙醇浸泡60 s，0.1%升汞溶液消毒15 min，无菌水冲洗3～5次备用。

1.2.2 种子的萌发 将消毒好的果荚放在超净工作台上，用灭过菌的解剖刀剖开果荚，再用无菌镊子取出未成熟的种子，接种于不同的培养基上（表1），每瓶接种20粒种子，每处理接种10瓶，在2 000 lx，12 h/d，（25±2） ℃条件下培养40 d观察种子萌发情况。

1.2.3 增殖培养基筛选 采用L9（34）正交设计，选择基础培养基、IAA、6-BA、土豆汁4个因素，每个因素设计3个水平，设计方案如表2所示，每瓶接种20个芽，接10瓶，培养50 d后调查硬叶斯垂科特的增殖情况。

1.2.4 壮苗培养及移栽 将增殖后的硬叶斯垂科特幼苗进行分株，并接入壮苗培养基1/4MS+1.0 mg/L IAA+80 g/L香蕉汁+25 g/L蔗糖+6 g/L琼脂，pH 5.8，培养方式采用膜袋培养40 d，移入温室中驯化15 d后进行移栽，30 d后观察其成活率。

2 结果与分析

2.1 初始培养基对硬叶斯垂科特种子萌发的影响

为获得较优的硬叶斯垂科特种子萌发培养基，设计了9种培养基，将硬叶斯垂科特的种子接种到培养基后，40 d调查萌发率和幼苗生长情况（表3）。由表3可知，A2处理较有利于硬叶斯垂科特种子的萌发，萌发率达89%，同A4、A6、A8处理形成显著差异，同A1、A3、A5、A7、A9处理差异不显著，且A2处理幼苗生长更加健壮，叶色翠绿，并且大多数芽苗长出了2片以上真叶。另外，随着6-BA含量的升高，幼苗逐渐出现轻微玻璃化的现象，鉴于硬叶斯垂科特幼苗对6-BA较敏感，在下面芽苗增殖培养基配方的设计中将采用低水平的6-BA。

2.2 不同培养基对硬叶斯垂科特幼苗增殖的影响

采用L9（34）正交设计进行硬叶斯垂科特增殖培养，结果见表4。由表4可知，通过因素内水平极差（R）的大小得到参试的4个因素对硬叶斯垂科特增殖影响的主次关系为C、D、B、A，说明细胞分裂素6-BA对硬叶斯垂科特的增殖起着重要的作用。根据各因素水平均值的大小，可以得到最优组合水平为A1B2C2D2。

用SPSS11.5统计软件对试验结果进行分析，从表5可以看出，在影响硬叶斯垂科特增殖培养的4个因素中，只有细胞分裂素6-BA的浓度对硬叶斯垂科特增殖影响达到显著水平，而基础培养基、IAA浓度和土豆汁浓度这3个因素对其增殖影响都不显著。

综合直观分析与方差分析结果可知，在硬叶斯垂科特的增殖培养中，以1/2MS为基础培养基添加1 mg/L IAA，0.2 mg/L 6-BA以及80 g/L土豆汁时，幼苗的增殖率最高，长势也最好，4个因素的最佳水平组合为A1B2C2D2，即增殖培养基的配方为1/2MS+1.0 mg/L IAA +0.2 mg/L 6-BA +80 g/L土豆汁+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂，pH 5.8。

2.3 硬叶斯垂科特的壮苗及移栽

将增殖后的硬叶斯垂科特幼苗进行分株，并接入壮苗培养基1/4 MS+1.0 mg/L IAA+80 g/L香蕉汁+25 g/L蔗糖+6 g/L琼脂，pH5.8，采用塑料膜袋培养40 d后，小苗长至1 cm左右，移入温室驯化、炼苗15 d，开袋洗苗后直接将幼苗平放在蛭石上面或粘于泡沫板上，正常管理即可。由于硬叶斯垂科特可以依靠密布于表面的鳞片从空气中吸收水分和养分，其抗逆性很强，移栽成活率可达95%以上。

3 小结

在硬叶斯垂科特的组培快繁体系研究中，采用未成熟种子作为外植体，整个快繁过程分为种子萌发培养、增殖培养和壮苗培养三个阶段，种子萌发的最佳培养基为1/2 MS+1.0 mg/L IAA+80 g/L土豆汁+25 g/L蔗糖+6 g/L琼脂，40 d后有89%的种子萌发成幼苗，并且大多长出2片真叶，叶色翠绿，植株健壮；增殖培养以1/2 MS+1.0 mg/L IAA +0.2 mg/L 6-BA +80 g/L土豆汁+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂为佳，50 d后的增殖率达2.03，植株较为健壮，无玻璃化现象。

在种子萌发培养过程中，发现硬叶斯垂科特幼苗对细胞分裂素6-BA较敏感，较高浓度的6-BA易引起硬叶斯垂科特幼苗的轻微玻璃化，故在增殖培养中采用了低水平的6-BA。土豆汁和香蕉汁都是天然附加物，含有丰富的氨基酸、矿物质、维生素、碳水化合物和天然激素等，土豆汁具有促进种子萌发和幼苗增殖的作用，而香蕉汁则有利于植物的壮苗和生根[9]，因此，在种子萌发和幼苗增殖培养基中添加了80 g/L的土豆汁，在壮苗培养基中添加了80 g/L的香蕉汁。考虑到将来硬叶斯垂科特组培工厂化育苗的要求，在壮苗培养时采用了膜袋培养方式，可以大幅度降低企业的生产成本，且方便运输。

在硬叶斯垂科特增殖培养基的配方筛选中采用了正交设计，该方法应用于植物离体培养的研究，国内的报道最早见于在籼稻（Oryza sativa subsp. indica）花药培养中的应用[10]。后来在延胡索（Corydalis yanhusuo）和党参（Codonopsis pilosula）的组织培养试验中研究者也采用正交设计的方法并取得了良好的试验结果[11，12]，在硬叶斯垂科特的增殖培养中尚未见报道。本研究在硬叶斯垂科特的增殖培养中采用了4因素3水平试验，如果全部实施，需要配制34（81）种培养基，但利用正交设计，只配制了9种培养基就达到了目的，大大提高了试验效率，简化了研究方案，缩短了试验进程。但是，正交设计是一种均一化的设计方案，不可能包含所有处理组合，所得到的最佳组合也不一定是最优的配方，因此，为获得最优配方还需进行进一步试验。

参考文献：

[1] 张 蕾.空气凤梨的引种应用及其生物学特性初步研究[D].兰州：甘肃农业大学，2008.

[2] HEUSSER C J. Age vegetation and climate of subtropical Chile[J]. Palaeogeography， Palaeoclimatology， Palaeoecology， 1990， 80（2）： 107-127.

[3] CERVANTES S E， GRAHAM E A， ANDRADE J L. Light microhabitats， growth and photosynthesis of an epiphytic bromeliad in a tropical dry forest[J]. Plant Ecology， 2005，179（1）：107-118.

[4] FIGUEIREDO A M G， SAIKI M， TICIANELLI R B， et al. Determination of trace elements in Tillandsia usneoides by neutron activation analysis for environmental biomonitoring[J].Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry，2001，249（2）： 391-395.

[5] FIGUEIREDO A M G， ALCAL？魣 A L， TICIANELLI R B， et al. The use of Tillandsia usneoides L. as bioindicator of air pollution in Sao Paulo， Brazil[J]. Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry，2004，259（1）：59-63.

[6] FIGUEIREDO A M G， NOGUEIRA C A， SAIKI M， et al. Assessment of atmospheric metallic pollution in the metropolitan region of S？觔o Paulo， Brazil， employing Tillandsia usneoides L. as biomonitor[J]. Environmental Pollution， 2007， 145（1）：279-292.

[7] 俞禄生.神奇的无根花卉空气凤梨[M].北京：中国农业出版社，2009.

[8] MANHART J R.Spanish Moss-Tillandsia usneoides L.[DB/OL]. http：//plant-materials.Nrcs.Usda.Gov/intranet/pfs.html，2002.

[9] 王永平，史 俊.园艺植物组织培养[M].北京：中国农业出版社，2010.

[10] 广东省植物研究所遗传室，广东师范学院数学系.用正交与不完全区组试验法提高籼稻花药培养成功率[J].广东师范学院学报，1976（1）：100-112.

[11] 张自国，严 霄，王凤仙，等.正交设计在植物组织培养基研究中的应用[J].植物生理学通讯，1985（5）：46-48.

[12] 孟玉玲，谷祝乎.正交设计在诱导植物体细胞胚胎发生中的应用[J].西北植物学报，1995，13（1）：10-15.