皮肤扩张急性期miRNA表达谱的变化及关键miRNA的筛选

刘文辉 黄晓璐 李海洲 余庆雄 梁筱 周怡雯 李青峰

皮肤扩张急性期miRNA表达谱的变化及关键miRNA的筛选

刘文辉 黄晓璐 李海洲 余庆雄 梁筱 周怡雯 李青峰

目的明确扩张急性期miRNA表达谱的变化，筛选出其中的关键miRNA。方法建立大鼠皮肤扩张模型，在扩张急性期取材，以未扩张皮肤为对照，利用miRNA芯片检测miRNA表达谱的变化，并利用t检验和差异表达的倍数变化，筛选出关键miRNA。利用TargetScan和miRDB数据库预测关键miRNA的靶点，并通过KEEG和IPA数据库对预测靶点进行通路分析，以探究关键miRNA调控皮肤扩张急性期的可能机制。结果本研究筛选出11个关键miRNA，这些关键miRNA调控多个与增殖分化、血管化、纤维化以及肿瘤发生发展相关的通路。结论本研究筛选出皮肤扩张急性期的11个关键miRNA，调控扩张过程中多个重要通路的变化，可以作为调控皮肤扩张的靶点。

皮肤扩张小分子核糖核酸通路分析

皮肤软组织扩张术是整复外科的重要手段。然而常规扩张提供的皮肤有限，不能满足大面积缺损修复的需要。因此，促进皮肤的再生能力，提高扩张效率，一直是整复外科的研究热点之一。目前，有研究认为罂粟碱[1-2]、雌三醇[3]、A型肉毒毒素[4]、二甲亚砜[5]、碱性成纤维细胞生长因子[6]、钙通道阻滞剂[7]和骨髓间充质干细胞[8]等能够提高扩张效率，但由于毒副作用、维持时间、给药途径等因素，而使其应用受到限制。临床上尚缺乏能有效促进皮肤再生并提高扩张效率的方法。尽管已从组织和细胞水平上详细了解了扩张过程中机体的各种变化，但基因水平上尚缺乏系统全面的认识，不能明确扩张过程中的关键分子，并针对这些关键分子实行有效的干预。

microRNA（miRNA）是体内一类重要的转录后调节非编码RNA。尽管哺乳动物中编码miRNA的基因仅占整个基因组的1%～5%，却可能调控着超过1/3的人类基因[9]。目前已经发现超过上千种miRNA，调控分化、增殖、凋亡等生理过程[10]，miRNA的组织/细胞特异性表达、靶向调节和给药方式多样等特性使其成为理想的疾病诊断标志和治疗靶点[11-12]。然而，扩张过程中miRNA的变化尚未见报道，明确这些变化将有助于加深对扩张过程中各种变化的理解，从而为提高扩张效率提供新的思路。

在皮肤扩张的不同阶段，随着炎症、血流动力学和生物力学等因素的变化，细胞的生理状态也在发生着变化。研究证实，扩张急性期中，机械张力能较快开启增殖相关通路[13-16]，细胞的增殖能力也会迅速增强，然后逐渐恢复正常[17-18]。这种变化趋势表明，扩张急性期有可能包含皮肤再生的关键变化，因此有必要对扩张急性期的各种变化加以明确。本研究的目的是明确扩张急性期中miRNA的变化，找出其中的关键miRNA，并对其功能进行生物信息学分析，为进一步的干预实验筛选靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物及材料

雄性SD大鼠（我院SPF级动物实验中心），7～8周龄；20 mL皮肤软组织扩张器（广州万和整形材料有限公司）；RNA提取试剂盒（上海信帆生物科技有限公司）；miRNA芯片采用Affymetrix microRNA 3.0基因芯片平台（上海伯豪生物技术有限公司）。

1.2 建立扩张模型

将3只SD大鼠腹腔内注射麻醉，背侧皮肤备皮。麻醉后，在大鼠颈部后方作3 cm切口，切开皮肤、皮下至深筋膜浅层。然后向头侧及尾侧剥离形成腔隙。其中尾侧剥离范围为3 cm×6 cm。向头侧腔隙中放置扩张器注射壶，并将扩张器植入尾侧剥离腔隙，术毕，缝合切口。术后1周待切口愈合后，向扩张器内注入40 mL无菌生理盐水。

1.3 RNA提取

注水2 h后，麻醉实验动物，背部皮肤备皮，标记扩张皮肤中心区域（约2 cm×2 cm），快速抽走扩张器内无菌生理盐水，捏起扩张皮肤，在标记区域附近作切口，迅速剪下标记区域皮肤，另在背部未扩张区域剪下相同大小的皮肤作为对照。将取下的皮肤在冰上匀浆，并用总RNA提取试剂盒提取皮肤标本中的RNA。

1.4 miRNA芯片

将RNA样本提交给上海伯豪生物技术有限公司，委托其进行miRNA芯片的杂交、数据读取和正态化工作。

1.5 差异miRNA筛选和靶点预测

对扩张与未扩张皮肤的miRNA表达数据进行双尾t检验，P＜0.05的基因为差异表达的miRNA，并计算其在扩张与未扩张皮肤中差异表达的倍数变化。差异表达倍数达到1.5倍的即为关键miRNA。然后利用TargetScan（www.targetscan.org）和miRDB（mirdb.org/miRDB）数据库，分别对筛选出的关键miRNA进行靶点预测，取两者的交集作为预测靶点进行下一步分析。

1.6 miRNA靶点的通路分析

对预测出的miRNA靶点，利用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEEG）数据库和Ingenuity Pathway Analysis（IPA，www.ingenuity.com）数据库进行通路分析，明确这些靶点所涉及的生理功能和通路。

2 结果

2.1 差异miRNA

扩张与未扩张皮肤差异表达的miRNA共有41个，其中表达倍数变化超过1.5倍的有11个（表1）。

2.2 miRNA靶点预测

对筛选出的miRNA进行靶点预测（表1），除rno-miR-184和rno-miR-702-5p外，其余关键miRNA预测出的靶点较多，提示其调节的细胞功能较广泛。

2.3 miRNA靶点的通路分析

利用KEEG数据库和IPA数据库对miRNA靶点进行通路分析。KEEG（图1A）的结果表明，筛选出的11个miRNA调控了Wnt和MAPK等通路。IPA（图1B）的分析结果表明，11个miRNA参与了FGF、EGF、NF-κB、ERK/MAPK、EMT、PDGF、VEGF和TGF-β等通路的调节。

图1 miRNA靶点的通路分析结果Fig.1 Pathway analysis results of miRNA targets

表1 皮肤扩张前后差异表达的miRNATable 1 Differentially expressed miRNAs after skin expansion

3 讨论

本研究首次明确了皮肤扩张急性期miRNA表达谱的变化，从中筛选出了11个差异表达倍数变化较大的miRNA，并通过这对些关键miRNA调节的靶点进行生物信息学分析，明确了这些miRNA可能调节的生理功能。

通路分析的结果表明，11个miRNA参与调控了Wnt、MAPK、FGF、EGF、NF-κB、ERK/MAPK、EMT、PDGF、VEGF和TGF-β等通路，这些通路在细胞增殖分化、血管化、纤维化以及肿瘤的发生发展等过程中都起到了重要的作用，表明这11个miRNA通过对其靶点的调控，能广泛地影响皮肤的再生能力。因此，这11个皮肤急性扩张期的关键miRNA可作为未来实验的干预靶点。

Dharap等[19]发现，在大脑的缺血预处理模型中，miR-485、miR-331和miR-21都有显著的差异表达，说明这3个miRNA在组织的缺血适应中起到了一定的作用。Redova等[20]同样证实了miR-21在缺氧状态下的差异表达。而本研究也发现这3个miRNA有着显著的差异表达。因扩张过程中皮肤处于相对缺血缺氧的状态，因此这3个miRNA可能参与了皮肤对这种相对缺血缺氧状态的适应过程。另外，本研究发现，关键miRNAs调控了VEGF通路的功能，这有可能是皮肤适应相对缺血状态的关键机制之一。

Liu等[21]发现，miR-21与TGF-β1相互调节，并且两者间存在正反馈作用；Bronnum等[22]发现，miR-21具有调节EMT的作用，这和本研究通路分析的结果是一致的。由于TGF-β对成纤维细胞、角质细胞和多种炎症细胞存在广泛的作用[23]，而EMT在多种纤维化疾病中也具有重要的作用[24-25]，因此miR-21可能通过对TGF-β和EMT的调控对皮肤扩张进行调节。另外，Gabriely等[26]认为，miR-21具有调控基质金属蛋白酶家族（MMPs）的作用，而MMPs参与了NF-κB[27]、ERK[28]和EMT[25，29]等通路的调节，并且在胶原沉积和组织重塑中发挥着重要作用[30]。因此，MMPs是也可能是miR-21调控皮肤扩张的重要中间分子之一。

本研究尚存在一定的局限。由于皮肤扩张是一个长期的过程，在扩张的不同阶段，随着炎症、血流动力学和生物力学等因素的变化，细胞的生理状态存在着不同的变化。因此，要明确扩张过程中的各种变化，需要一系列时间序列的基因芯片数据，未来的研究将会着力于完善相关数据，明确扩张过程中miRNA表达谱的变化，并追踪本研究发现的11个关键miRNA的变化趋势，从而进一步明确11个关键miRNA调控皮肤扩张的机制。

本研究首次明确了皮肤扩张急性期miRNA表达谱的变化，有助于在基因水平上加深我们对扩张过程中各种变化的理解。本研究同时筛选出了11个关键miRNA，并利用生物信息学方法发现它们调控多个影响皮肤再生能力的重要通路。因此，这11个关键miRNA可作为调控皮肤扩张的靶点，指导进一步的实验研究。

[1]Tang Y,Luan J,Zhang X.Accelerating tissue expansion by application of topical papaverine cream[J].Plast Reconstr Surg, 2004,114(5):1166-1169.

[2]Lee P,Squier CA,Bardach J.Enhancementoftissue expansion by anticontractile agents[J].Plast Reconstr Surg,1985,76(4):604-610.

[3]Tercan M,Cokkeser Y,Ozyazgan I,et al.Facilitated tissue expansion with topical estriol[J].Ann Plast Surg,2001,46(6):617-620.

[4]Chenwang D,Shiwei B,Dashan Y,et al.Application of botulinum toxin type A in myocutaneous flap expansion[J].Plast Reconstr Surg,2009,124(5):1450-1457.

[5]Raposio E,Santi PL.Topical application of DMSO as an adjunct to tissue expansion for breast reconstruction[J].Br J Plast Surg, 1999,52(3):194-197.

[6]胡亚兰,郭树忠,晏培松,等.碱性成纤维细胞生长因子和硫糖铝联合局部应用对扩张皮肤组织结构的影响[J].中国修复重建外科杂志,2002,16(5):340-344.

[7]Copcu E,Sivrioglu N,Sisman N,et al.Enhancement of tissue expansion by calcium channel blocker:A preliminary study[J]. World J Surg Oncol,2003,1(1):19.

[8]Yang M,Li QF,Sheng LL,etal.Bone marrow-derived mesenchymal stem cells transplantation accelerates tissue expansion by promoting skin regeneration during expansion[J].Ann Surg,2011,253(1): 202-209.

[9]Lewis BP,Burge CB,Bartel DP.Conserved seed pairing,often flanked by adenosines,indicates that thousands of human genes are microRNA targets[J].Cell,2005,120(1):15-20.

[10]Zhang B,Wang Q,Pan X.MicroRNAs and their regulatory roles in animals and plants[J].J Cell Physiol,2007,210(2):279-289.

[11]Shukla GC,Singh J,Barik S.MicroRNAs:processing,maturation, target recognition and regulatory functions[J].Mol Cell Pharmacol, 2011,3(3):83-92.

[12]Love TM,Moffett HF,Novina CD.Not miR-ly small RNAs:Big potential for microRNAs in therapy[J].J Allergy Clin Immunol, 2008,121(2):309-319.

[13]Yano S,Komine M,Fujimoto M,et al.Mechanical stretching in vitro regulates signal transduction pathways and cellular proliferation in human epidermal keratinocytes[J].J Invest Dermatol,2004,122 (3):783-790.

[14]Hofmann M,Zaper J,Bernd A,et al.Mechanical pressureinduced phosphorylation of p38 mitogen-activated protein kinase in epithelial cells via Src and protein kinase C[J].Biochem Biophys Res Com,2004,316(3):673-679.

[15]Takei T,Rivas-Gotz C,Delling CA,et al.Effect of strain on human keratinocytes in vitro[J].J CellPhysiol,1997,173(1):64-72.

[16]Pietramaggiori G,Liu P,Scherer SS,et al.Tensile forces stimulate vascular remodeling and epidermal cell proliferation in living skin[J].Ann Surg,2007,246(5):896-902.

[17]Olenius M,Dalsgaard CJ,Wickman M.Mitotic activity in expanded human skin[J].Plast Reconstr Surg,1993,91(2):213-216.

[18]Austad ED,Thomas SB,Pasyk K.Tissue expansion:dividend or loan[J]?Plast Reconstr Surg,1986,78(1):63-67.

[19]Dharap A,Vemuganti R.Ischemic pre-conditioning alters cerebral microRNAs that are upstream to neuroprotective signaling pathways [J].J Neurochem,2010,113(6):1685-1691.

[20]Redova M,Svoboda M,Slaby O.MicroRNAs and their target gene networks in renal cell carcinoma[J].Biochem Biophy Res Com, 2011,405(2):153-156.

[21]Liu G,Friggeri A,Yang Y,et al.miR-21 mediates fibrogenic activation of pulmonary fibroblasts and lung fibrosis[J].J Exp Med,2010,207(8):1589-1597.

[22]Bronnum H,Andersen DC,Schneider M,et al.miR-21 promotes fibrogenic epithelial-to-mesenchymal transition of epicardial mesothelialcells involving Programmed Cell Death 4 and Sprouty-1[J].PLoS One,2013,8(2):e56280.

[23]Hotz B,Visekruna A,Buhr HJ,et al.Beyond epithelial to mesenchymal transition:a novel role for the transcription factor Snail in inflammation and wound healing[J].J Gastrointest Surg, 2010,14(2):388-397.

[24]Lee JM.The epithelial-mesenchymal transition:new insights in signaling,development,and disease[J].J Cell Biol,2006,172(7): 973-981.

[25]Lee K,Nelson CM.New insights into the regulation of epithelialmesenchymal transition and tissue fibrosis[J].Int Rev Cell Mol Biol,2012,294:171-221.

[26]Gabriely G,Wurdinger T,Kesari S,et al.MicroRNA 21 promotes glioma invasion by targeting matrix metalloproteinase regulators [J].Mol Cell Biol,2008,28(17):5369-5380.

[27]Okamoto H,Yoshio T,Kaneko H,et al.Inhibition of NF-kappaB signaling by fasudil as a potential therapeutic strategy for rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheum,2010,62(1):82-92.

[28]Pillinger MH,Rosenthal PB,Tolani SN,et al.Cyclooxygenase-2-derived E prostaglandins down-regulate matrix metalloproteinase-1 expression in fibroblast-like synoviocytes via inhibition of extracellular signal-regulated kinase activation[J].J Immunol, 2003,171(11):6080-6089.

[29]Nelson CM,Khauv D,Bissell MJ,et al.Change in cell shape is required for matrix metalloproteinase-induced epithelialmesenchymal transition of mammary epithelial cells[J].J Cell Biochem,2008,105(1):25-33.

[30]Shuman Moss LA,Jensen-Taubman S,Stetler-Stevenson WG. Matrix metalloproteinases:changing roles in tumor progression and metastasis[J].Am J Pathol,2012,181(6):1895-1899.

miRNA Expression and Key miRNA Screening in Acute Stage of Skin Expansion

LIU Wenhui,HUANG Xiaolu,LI Haizhou,YU Qingxiong,LIANG Xiao,ZHOU Yiwen,LI Qingfeng.
Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:LI Qingfeng(E-mail:dr.liqingfeng@shsmu.edu.cn).

Objective To determine the miRNA expression and screen key miRNA in acute stage of skin expansion. Methods Skin expansion model was established and skin samples were harvested in acute stage.Unexpanded skin was also harvested as control.miRNA microarray was undertaken to reveal the miRNA expression change during acute expansion process.T test and fold change of differential expression were applied to screen key miRNAs.TargetScan and miRDB were used to predict target genes of key miRNA.Pathway analysis was performed for target genes by KEEG and IPA.Results Eleven key miRNAs were detected which regulate pathways involve cell proliferation,differentiation,vascularization,fibrosis and tumorigenesis.Conclusion Eleven key miRNAs determined in the present study regulate important pathways in acute stage of skin expansion and they could serve as targets in skin expansion.

Skin expansion;MicroRNA;Pathway analysis

R622

A

1673－0364（2015）01－0010－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2015.01.003

2015年1月10日；

2015年1月30日）

国家自然科学基金（No：81230042）。

200011上海市上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科。

李青峰（E-mail：dr.liqingfeng@shsmu.edu.cn）。