采油污水对斑马鱼POD酶的影响

张 薇，徐长君，吴 杨，刘超群

（大庆师范学院黑龙江大庆 163712）

采油污水对斑马鱼POD酶的影响

张 薇，徐长君*，吴 杨，刘超群

（大庆师范学院黑龙江大庆 163712）

为了研究采油污水对水生动物的毒性效应，以斑马鱼为实验材料，将采油污水分别稀释为1.5%，1.9%，3.0%的浓度梯度，利用提取酶液技术和比色法，检测经采油污水处理的斑马鱼头部、肌肉、内脏的过氧化物酶（POD）酶活性，进而确定不同浓度的采油污水对斑马鱼POD酶活性的影响。结果显示，头部对照组POD酶活性为0.64 U·mg_1，1/4致死浓度组POD酶活性为0.8 U·mg_1，半致死浓度组POD酶活性为1.76 U· mg_1，全致死浓度组POD酶活性为2.4 U·mg_1；肌肉对照组和内脏对照组情形与此相似。结论是随着采油污水浓度的增加，细胞内的过氧化物酶增多，斑马鱼体内POD酶活性变大说明采油污水已对斑马鱼产生了毒性影响。为此必须严密关注采油污水的处理工作，以防造成环境污染。

采油污水；斑马鱼；POD酶；急性毒性；吸光值

过氧化物酶体含有丰富的酶类，主要是过氧化物酶，过氧化氢酶和氧化酶。过氧化物酶体普遍存在于真核生物的各类细胞中，在肝细胞和肾细胞中数量尤其多。过氧化物酶是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶［1］，主要存在于细胞的过氧化物酶体中，以铁卟啉为辅基，可催化过氧化氢、氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。过氧化物酶体的标志酶是过氧化氢酶，它的作用主要是将过氧化氢（H2O2）水解。对细胞起保护作用。

采油污水是伴随石油开采过程中产生的废水。其水质具有以下几方面特点：含油量远高于各种回用所要求的水质标准；富含有机物；含有大量离子，其中既有成垢离子，又有腐蚀性的离子。采油污水外排时进入水体后的危害是多方面的：如在水上形成油膜，能阻碍水体复氧作用，油类粘附在鱼鳃上，可使鱼窒息；粘附在藻类、浮游生物上，可使它们死亡；抑制水鸟产卵和孵化，严重时使鸟类大量死亡；还能使水产品质量降低。

水环境是大部分污染物的最终汇集场所，也是水生动物赖以生存的环境，研究典型环境污染物对鱼类的毒性效应［2_4］不仅可以较早发现污染物的危害并评价环境的质量，而且可以预测其对陆生动物甚至人类可能产生的后果，这对于保护水环境和水生资源、保障人类健康、建设和谐矿区均具有重要的现实意义［5］。

1 材料与方法

1.1 实验用鱼的选取

实验用鱼为斑马鱼，购于大庆让胡路区博奥国际花鸟鱼市场。在同一实验中要求试验鱼，必须同属、同种、同龄、尽量相同大小。鱼的平均体长2 cm为合适。同组鱼中最大体长不超过最小体长的1.5倍。选择体色光泽、鱼鳍完整舒展、行动活泼、逆水性强、大小无太大悬殊、无任何疾病的鱼作为试验鱼。任何畸形鱼、外观上反常态的鱼都不得用作试验鱼。鱼类行为是鱼类对外界环境和体内环境变化的外在反应，包括游泳、摄食、生殖、呼吸以及避敌、攻击、求偶时改变体色等［6］。

1.2 实验用采油污水的配制

采油污水来自于大庆师范学院微生物驱油研究室所赠送。取适量采油污水，将其用8层纱布进行过滤，滤掉杂质及异物，并假设经过滤后的污水浓度为单位1，向其中加去离子水稀释，得到浓度分别为0.1，0.4，0.7，1.0，1.3，1.6等6个浓度梯度［7_8］（每个浓度设置1个平行组）。

1.2.1 试剂

0.05 mol·L_1pH值7.8磷酸缓冲液。取0.1 mol·L_1pH值7.8的磷酸钠缓冲液50 mL，移入100 m L容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。石英砂。0.05 mol·L_1愈创木酚（C7H8O2别名2-甲氧基酚，邻甲氧基酚，甲基儿茶酚）溶液。2%双氧水溶液。蒸馏水。

1.2.2 采油污水对斑马鱼的致死和半致死浓度

用1 000 mL烧杯分别盛装上述浓度的采油污水。另取2个1 000 m L烧杯，盛装静置1周的自来水作为对照组。试验溶液调节至相应温度后，从驯养鱼群中随机取斑马鱼并迅速放入各试验容器中，每个容器放入8条。以96 h为一个试验周期，在24，48，72和96 h时记录实验鱼的死亡数，确定斑马鱼的致死浓度和半致死浓度范围［9］，如果没有任何肉眼可见的运动，如鳃的扇动、碰触尾柄、鱼鳍后无反应等，即可判断该鱼已死亡。

根据致死浓度和半致死浓度范围，再将此浓度分成6个浓度梯度，进一步缩小浓度范围，最终确定斑马鱼的1/4致死浓度、半致死浓度和致死浓度。

1.2.3 酶液提取

分别取0.4 g材料（头部、肌肉、尾部）于预冷的研钵中，加入8 m L预冷的0.05 mol·L_1磷酸缓冲液（pH值7.8）（先加2 m L，在冰浴下研磨成匀浆后，将匀浆转入10 m L离心管，再用6 m L冲洗），10 000 r·m in_1离心15 min，取上清液［10］定容至10 m L后于4℃保存。上清液用于过氧化物酶（POD）活性的测定。

1.2.4 愈创木酚法测定POD活性

设置3组待测浓度分别为致死浓度、半致死浓度和1/4致死浓度，再设置一个对照组，按表1加入各溶液。将上述各试管立即放入预先调好37℃的水浴锅中保温5 min以上（酶促反应），向对照管中加入0.1 m L酶液，混匀，在λ470 nm处调零，再向测定管中加入0.1 m L酶液，并且立即计时，混匀后进行比色测定，3 min时立即读取吸光度［11］。

各反应体系中试剂用量：对照组0.05 mol· L_1pH值5.5（7.8）磷酸缓冲液2.9 m L，2%双氧水溶液0 m L，0.05 mol·L_1愈创木酚溶液1.0 m L，蒸馏水3.0 m L；1/4致死组0.05 mol·L_1pH值5.5（7.8）磷酸缓冲液2.9 m L，2%双氧水溶液1.0 m L，0.05 mol·L_1愈创木酚溶液1.0 m L，蒸馏水2.0 m L；1/2致死组0.05 mol·L_1pH值5.5（7.8）磷酸缓冲液2.9 m L，2%双氧水溶液1.0 mL，0.05 mol·L_1愈创木酚溶液1.0 m L，蒸馏水2.0 mL；全致死组0.05 mol·L_1pH值5.5（7.8）磷酸缓冲液2.9 m L，2%双氧水溶液1.0 m L，0.05 mol·L_1愈创木酚溶液1.0 m L，蒸馏水2.0 m L。

1.3 统计分析

以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以ΔD470·g_1（鲜重）·min_1表示。也可以用每分钟内D470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位（U）表示。酶活性/（U·mg_1）=ΔD470×酶提取液总量/（样品鲜重×测定时酶液用量）。

2 结果与讨论

2.1 吸光度和POD酶活力

不同浓度采油污水处理后斑马鱼组织提取液的吸光度值见表1。

通过表1可见，采油污水在同一浓度下，随着处理时间由1 m in到2 min再到3 min，无论是头部、肌肉、还是内脏的吸光值都在增加。

表1 处理后斑马鱼体内的吸光值

2.2 POD酶活力

POD酶活力检测值见表2。

表2 处理后斑马鱼体内POD酶活力

通过表2可见，随着采油污水浓度的增大，头部、肌肉、内脏的吸光值也在增加。随着采油污水浓度的升高，POD酶活性明显增强。

上述实验结果显示，在相同的处理时间和环境条件下，随着实验组设置的采油污水浓度的逐步增加，存在于细胞的过氧化物酶体中的过氧化物酶就增多，斑马鱼体内（头部、肌肉、内脏）POD酶活性就会随之变大。这说明采油污水的毒性已对斑马鱼的生理产生影响。而且采油污水浓度的增大对斑马鱼的影响也随之增大，最终使斑马鱼死亡。

3 小结

随着采油污水浓度的升高，斑马鱼的POD酶活性也随之增强，说明采油污水对斑马鱼的危害情况随其浓度的增加而逐渐增大。可根据实验结果初步判断采油污水的毒性大小。过氧化物酶体普遍存在于真核生物的各类细胞中，但在肝细胞和肾细胞中数量特别多，所以，相对于头部和肌肉，内脏的POD酶的活性更大。

水是人类赖以生存的宝贵资源。大庆油田是我国目前最大的油田，也是世界上为数不多的特大型砂岩油田之一。在采油的过程中会产生大量的采油污水，油田采油污水成分较复杂，含有的苯和萘等有毒物质［12］，严重影响水生生物及植被，这将直接威胁到人类的身体健康。

生物监测［13］是利用生物组分、个体、群体或群落对环境污染或变化所产生的反应来阐明污染状况，从生物学角度为环境质量的监测和评价提供依据［14］。

大庆是绿色油化之都，天然百湖之城。伴随着原油储量的日渐减少，大庆肩负着由石油城向经济城、环保城以及向国际化大都市转变的重任。良好的环境是大庆实现产业转型的基础。利用先进的采油技术，提高石油采收率的同时，改善采油污水的处理方法，开发生物处理技术，减少有害污水的排放，妥善处理好采油污水，避免采油污水等对环境造成破坏，保持优良的环境，实现可持续发展的伟大战略构想，为大庆建设百年油田贡献力量。

［1］ 宋志慧，王庆伟，杨鲁娜，等.三苯基锡和五氯酚对斑马鱼急性毒性作用和过氧化物酶活性的影响［J］.安徽农业科学，2011，39（20）：12201_12204.

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（责任编辑：卢福庄）

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0528-9017（2015）02-0285-03

10.16178/j.issn.0528-9017.20150244

2014-09-24

黑龙江省大学生创新创业项目（201310235021）

张 薇（1992_），女，黑龙江双鸭山人，大庆师范学院生物科学系2011级学生。

徐长君。E-mail：1253122075@qq.com。

文献著录格式：张薇，徐长君，吴杨，等.采油污水对斑马鱼POD酶的影响［J］.浙江农业科学，2015，56（2）：285_287.