贝那普利联合低分子肝素对大鼠肾纤维化的作用研究

卢涛 朱春玲

（1.海口市人民医院肾内科，海南 海口 570000；2.贵阳医学院附属医院肾内科，贵州 贵阳 550004）

肾间质纤维化是指在各种致病因子作用下，间质细胞及细胞基质蛋白合成增加，降解受抑制造成细胞外基质（ECM）的大量堆积导致的［1］。低分子肝素（LMWH）具有抑制肾小球系膜细胞和基质增生的作用及抗肾间质纤维化作用［1］。本文通过观察联用贝那普利和LMWH 与单用贝那普利对转化生长因子－β1（TGF－β1）、基质金属蛋白酶－2（MMP－2）的表达和对肾组织结构的影响，以探讨药物对肾间质纤维化的作用效果，并为临床治疗提供更多的理论依据。

1 资料与方法

1.1 实验组动组物组雄组性SD组大组鼠72组只，2组个组月组龄组左右，体质量150～200g，由贵阳医学院实验动物中心提供。

1.2 主要试剂 盐酸贝那普利片（商品名洛丁新，成都地奥制药集团有限公司，批号070501），低分子肝素钙注射液（商品名尤尼舒，海南通用同盟药业有限公司，批号20060401，国药准字H20010300）。以下试剂均购自武汉博士德生物工程有限公司，兔抗鼠TGF－β1（编号BA0290），兔抗鼠MMP－2（编号BA2200），生物素标记羊抗兔IgG（编号BA1003），链酶亲和素－过氧化物酶复合物（编号SA1082），封闭用正常山羊血清（编号AR0009），DAB显色剂（编号AR1022）。

1.3 动物造模 左侧行单侧输尿管结扎术（UUO），建立UUO 模型。假手术组打开腹腔后即关闭腹腔。

1.4 分组 健康SD 大鼠72只，预养1周后，空腹12h，随机分为4组：假手术组、模型组、贝那普利组、贝那普利＋LMWH组，每组18只。贝那普利组术后给予贝那普利10 mg／（kg·d）灌胃，贝那普利＋LMWH组给予贝那普利10 mg／（kg·d）灌胃及LMWH 200IU／（kg·d）皮下注射。

1.5 标本采集 乙醚麻醉后，腹部作纵形切口，分离出左肾，用生理盐水反复灌洗至发白，摘除肾脏，剔除包膜，横断切取约0.5cm 柱状体2 块，置于4%多聚甲醛中固定12h，石蜡包埋，切片。HE 染色：常规制片观察。Masson 染色：常规制片观察。免疫组化：采用SABC法，常规制片观察。

1.6 肾小管间质损伤评分 在低倍镜下（×200）依序单盲法观察左上、右上、左下、右下、中间5个肾间质视野，按肾小管间质损伤评分标准评分并计算各个评分的均值，得出肾小管间质损伤指数。

1.7 免疫组化 TGF－β1 及MMP－2：细胞胞浆染上棕黄色为阳性细胞。在400倍光镜（LEICA DM 1000）下目测5个病变比较明显的视野并计数阳性细胞总数，结果以阳性细胞数／HP×400表示。

1.8 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件，计量资料采用方差分析，数据用（±s）表示，多组间用单因数方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况观察 假手术组：体质量稳定，精神状况良好；模型组：精神逐渐萎靡、消瘦；贝那普利组及贝那普利＋LMWH组：懒动，体质量稍减轻。

2.2 Masson 染色结果 假手术组：肾小管结构正常；模型组：术后5d，小管间质轻度增宽，少量炎性细胞浸润及胶原沉积；术后10d，小管间质中度增宽，小管结构破坏，偶有管腔塌陷，炎性细胞浸润，胶原成分增加；术后15d，小管间质损伤程度明显，3个时段比较差异有统计学意义（P＜0.05）。贝那普利组及贝那普利＋LMWH组均较同期模型组肾小管间质损伤指数减低（P＜0.05）。贝那普利＋LMWH组较同期贝那普利组肾小管间质损伤指数减低（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠肾小管间质损伤指数

2.3 TGF－β1 在各组的表达水平 假手术组水平最低，模型组水平最高（P＜0.05）。贝那普利组及贝那普利＋LMWH组均较模型组表达水平低（P＜0.05）。贝那普利＋LMWH组较贝那普利组表达水平低（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠肾小管间质TGF－β1的表达

2.4 MMP－2的表达水平 假手术组水平最高，模型组水平最低（P＜0.05）。贝那普利组及贝那普利＋LMWH组均较模型组水平高（P＜0.05）。贝那普利＋LMWH组较贝那普利组水平高（P＜0.05）。见表3。

表3 各组大鼠肾小管间质MMP－2的表达

3 讨论

肾间质纤维化几乎是所有慢性肾脏疾病发展到后期的病理学特征，是各种慢性肾脏疾病进展为终末期肾功能衰竭的共同通路。肾间质纤维化病变过程涉及细胞、细胞因子、ECM、生长因子及它们之间的相互作用［1］。在组调组节组因组子组中，TGF－β1组被组公组认组为是最主要的前纤维化因子［2］。作为一种强效的致纤维化因子，TGF－β1在肾间质纤维化发生、发展的多个环节起作用。ECM 在肾间质的过度沉积是引起肾间质纤维化的主要原因，ECM 的降解由细胞外基质降解酶系统介导，其中基质金属蛋白酶／基质金属蛋白酶抑制物（MMPs／TIMPs）的表达与活性异常在其中发挥重要的作用。许多肾脏疾病可以激活肾局部肾素－血管紧张素系统使血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）分泌增多，进而导致肾间质纤维化。用ACEI能抑制Ang Ⅱ引起的肾脏纤维化及炎症反应，对肾脏具有较好的保护作用［3－4］。本实验中模型组Masson染色显示间质胶原沉积加重，肾小管间质损伤指数升高，提示UUO 造模成功。模型组TGF－β1 表达渐增强而MMP－2表达渐减少。实验显示贝那普利组较同期模型组肾间质损伤指数低，差异均有统计学意义（P＜0.05），证实贝那普利有延缓肾间质纤维化的作用。贝那普利＋LMWH组较同期贝那普利组肾间质损伤指数减低（P＜0.05），提示在贝那普利使用的基础上加用LMWH 会进一步减轻肾间质纤维化。关于在贝那普利使用的基础上加用LMWH 会进一步改善肾间质纤维化的机制，有研究［5］显示肝素通过抑制TGF－β1启动子和防止核蛋白与调节 性AP－1 位 点组结组合，从组而组抑组制TGF－β1组表达。并且肝素可以促进内皮细胞表达细胞外基质降解酶t－PA 活性，促进细胞外基质金属蛋白酶的表达，从而促进ECM 的降解［6］。本实验显示贝那普利＋LMWH组较同期贝那普利组的TGF－β1表达水平减低、MMP－2表达水平升高（P＜0.05），提示在贝那普利使用的基础上加用LMWH 改善肾间质纤维化的机制之一可能与LMWH组对UUO组模型中TGF－β1、MMP－2组的组表组达组水组平组的组调组节组有组关。关组于LMWH组对UUO组模型组中TGF－β1、MMP－2组具组体组调节机制有待进一步研究。

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