补肾方与调肝方对月经模型小鼠子宫内膜增殖期、分泌期影响的比较研究*

河北中医学院 (石家庄050091)

陈进成 丁 芳△ 王 亮△ 杨淑英△△ 李春香 张 炜

中医学认为“肾藏精、主生殖，为先天之本”“肝藏血、主疏泄，女子以肝为先天”，肝肾两个“先天”决定其在女性生理、生殖的调节上发挥着极其重要的作用。基于此，中医妇科临床补肾滋肾、疏肝养肝法成为主要的治疗原则。［1］在卵巢分泌的甾体性激素作用下，子宫内膜经历着增殖、分化、崩解和修复的周期性变化，［2］近年生理生殖领域应用小鼠建立的月经模型为月经的机制研究以及月经性疾病的病理研究提供了优良的平台，［3－5］而研究的重点大都集中在子宫内膜的蜕膜化、崩解与早期修复环节。本研究则以生理性孕酮撤退的小鼠月经模型为平台，观察补肾方与调肝方对子宫内膜崩解前受性激素调控的增殖期和分泌期的影响，并对其影响因子子宫系数、血清中雌激素(E2)、孕激素(P)含量、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)及血管内皮因子(VEGF)的表达对比研究，以期为临床根据子宫内膜时相合理用药提供数据支持。

1 材料

1.1 实验动物 SPF 级雌性C57BL/6J 小鼠，体质量18～20 g，8～10 周龄，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，实验动物许可证号:SCXK(京)2009－0004。

1.2 药品与试剂 补肾方由熟地黄15 g，泽泻10 g，炒山药、沙苑子、枸杞子、巴戟天各15 g，肉桂4 g 等组成;调肝方由柴胡10 g，白芍、当归、香附各15 g，玫瑰花12 g，炒白术、茯苓各15 g 等组成;购于石家庄乐仁堂。将上述中药煎煮浓缩，制成含生药量为1.0 g/mL 的药液，4℃贮存备用。β－雌二醇 (E2，德国Alfa Aesar 公司，批号10152011)，孕酮 (P，美国Sigma 公司，批号P8783)。碘［125I］雌二醇(E2)放射免疫分析药盒，批号RG61405，碘［125I］孕酮(Prog)放射免疫分析药盒，批号RG51406D，天津九鼎生物工程有限公司。ER－α 抗体，批号980593 w，PR 抗体，批号20140603，VEGF 抗体，批号131210 w，β－actin，批号:140103 w，北京博奥森生物科技有限公司。二抗(辣根酶标记山羊抗兔IgG)，批号106484，北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 仪器BX53 型显微镜，OLYMPUS (日本);E4500 型微距摄像机，Nikon (日本)。

2 方法

2.1 动物分组与造模 C57BL/6J 雌性小鼠采用随机数字表法分为假手术组、模型组、补肾组、调肝组、调理肝肾组，每组10 只。除假手术组外，模型组与各给药组小鼠基于Brasted 等［4－5］的小鼠模型并进行适当修改建立小鼠月经模型。小鼠在乙醚麻醉下行双侧卵巢切除术，恢复1 周清除内源性激素干扰。按程序进行激素处理:第1～3 天皮下注射100 ng/d E2;第5～6 天无处理;第7 天将孕酮管皮下埋植于小鼠背部皮肤松弛处，并同时皮下注射50 ng/d 的P 和5 ng/d 的E2;第8～9 天皮下注射5 ng/d E2。

2.2 动物给药 灌胃方案:补肾组连续9 天灌胃补肾方;调肝组连续9 天灌胃调肝方;补肾调肝组于第1～4 天灌胃补肾方，5～9 天灌胃调肝方;各组给药量均为30.83 g/kg;假手术组与模型组每日给予等量的生理盐水。各组用药量均按人与动物的体表面积进行换算。［6］

2.3 样本采集 小鼠于程序处理的第4 天处死为T1 点，第9 天处死为T2 点。在取材点将小鼠摘眼球取血，以3 000 r/min，15 min 离心分离血清;取子宫，迅速与周围脂肪组织分离，拍照;部分子宫组织立即固定于4%多聚甲醛;部分组织立即置液氮中急冻，后转入－80℃保存，用于Real－time PCR 与Western blotting 蛋白印迹检测。

2.4 检测指标

2.4.1 子宫角外观、子宫系数与形态学观察:将子宫组织与外周脂肪组织分离，拍照观察子宫角外观形态，称重。计算子宫系数(小鼠子宫角湿重与小鼠体质量的比)=子宫湿重/体质量×100%。4%多聚甲醛固定的组织经梯度脱水后常规石蜡包埋，4 μm 连续切片，用于H＆E 染色，镜下观察子宫内膜形态学变化。

2.4.2 血清激素E2、P 的测定:采用放射免疫法测定血清中E2、P 的含量，严格按照药盒的说明书操作。

2.4.3 免疫组化法检测子宫组织ER－α、PR、VEGF 蛋白的表达:石蜡切片进行常规脱蜡复水，用柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)加热进行抗原修复，加一抗(1︰200)4℃过夜，二抗室温孵育20 min，DAB 显色，苏木精复染，脱水透明，中性树胶封片。图像分析依据阳性免疫反应的图像灰度选择合适的灰度分割阈值，实现双阈值分割，得到半灰度目标图像，以人机交互方式测定阳性免疫染色强度及面积，每个切片测5 个视野，由计算机计算出所测阳性反应物积分光密度(IOD)值，评价表达的强弱。

2.5 统计学方法 采用SPSS16.0 统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，对所测结果进行正态性及方差齐性检验。组内比较采用t 检验，组间比较采用单因素方差分析(One－Way ANOVA)，两两比较用LSD 检验，P＜0.05认为差异有显著性。

3 结果

3.1 各组小鼠子宫系数比较 与假手术组比较，模型组子宫系数显著性升高(P＜0.05);与模型组比较，各给药组子宫系数显著升高 (P＜0.05);与补肾组比较，调肝组与补肾调肝组在T2点子宫系数显著升高(P＜0.05);与调肝组比较，补肾组与补肾调肝组在T1 点子宫系数显著升高(P＜0.05)，如表1所示。

表1 各组小鼠子宫系数比较 (±s)

表1 各组小鼠子宫系数比较 (±s)

注:与假手术组比较，* P＜0.05;与模型组比较，△P＜0.05;与补肾组比较，▲P＜0.05;与调肝组比较，#P＜0.05

组别 样本数 T1 点 T2点假手术组 10/10 0.271±0.066 0.269±0.071模型组 8/7 0.405±0.064* 0.301±0.019*补肾组 8/7 0.550±0.036＊△# 0.316±0.025＊△调肝组 8/9 0.480±0.021＊△ 0.379±0.028＊△▲补肾调肝组 9/8 0.548±0.041＊△# 0.426±0.033＊△▲

3.2 各组小鼠子宫组织形态学观察 假手术组子宫角在整个过程中上皮完整，功能层细胞排列紧密，基底层间质细胞无明显变化。模型组，在E2作用下的T1 点，肉眼下可见小鼠子宫角肿大，内有液体充盈，外周血管密集;H＆E 染色可见子宫内膜呈单层立方上皮，核质较高，细胞核呈椭圆状，基质疏松。而在E2、P 联合作用下的T2 点，子宫体呈现红色，管腔未见肿大;H＆E 染色后内膜呈假复层改变，见分泌细胞，腔内现分泌物。与模型组比较，各给药组小鼠子宫的变化呈现相似的趋势，如图1所示。

图1 小鼠子宫外观形态与H＆E 染色，黑色方框标明位置的高倍视野(×100 与×400)，S 为假手术组及其高倍视野(×400)

3.3 各组小鼠血清中E2、P 含量的比较 与假手术比较，模型组血清中的E2、P 的含量均显著性增加(P＜0.05);与模型组比较，各给药组血清中的E2、P 的含量增加，但差异没有显著性(P＞0.05)，如表2示。

3.4 各组小鼠子宫组织中ER－α、PR 与VEGF表达的比较 免疫组织化学法检测显示假手术组小鼠子宫角可见ER－α、PR 与VEGF 的较弱阳性表达。ER－α 的阳性信号位于间质细胞的细胞质中;PR 阳性信号在上皮周围的细胞质中表达;VEGF的阳性信号于间质细胞的细胞质中表达。与假手术组比较，模型组小鼠的表达明显上调 (P＜0.05);与模型组比较，各给药组小鼠的表达显著上调(P＜0.05);与补肾组比较，调肝组与补肾调肝组在T2 点的表达量显著升高(P＜0.05);与调肝组比较，补肾组与补肾调肝组在T1 点的表达量显著升高(P＜0.05)，如表3所示。

表2 各组小鼠血清E2、P 的含量与比较 (±s)

表2 各组小鼠血清E2、P 的含量与比较 (±s)

注:与假手术组比较，* P＜0.05

组别 样本E2 (pg/mL)P (ng/mL)T1 点 T2点T1 点 T2点假手术组 10/10 8.253±0.812 9.639±0.719 0.622±0.316 0.706±0.434模型组 8/7 19.453±1.021* 41.320±0.743* 1.543±0.374* 78.981±2.662*补肾组 8/7 21.245±0.951* 42.114±0.913* 1.603±0.953* 79.826±1.493*调肝组 8/9 20.791±1.011* 41.833±2.002* 1.576±0.241* 80.233±1.092*调理肝肾组 9/8 21.102±0.803* 42.442±1.271* 1.595±0.213* 80.284±2.512*

表3 免疫组化测得各组小鼠子宫组织ER－α、PR 与VEGF 表达强弱的比较 (±s)

表3 免疫组化测得各组小鼠子宫组织ER－α、PR 与VEGF 表达强弱的比较 (±s)

注:与假手术组比较，* P＜0.05;与模型组比较，△P＜0.05;与补肾组比较，▲P＜0.05;与调肝组比较，#P＜0.05

组别 样本 ER－α T1 点 T2点PR T1 点 T2点VEGF T1 点 T2点假手术组 10/10 2.3±1.1 2.8±1.4 3.1±1.2 2.9±1.0 5.2±2.4 6.8±3.0模型组 8/7 15.4±2.2* 13.3±3.7* 25.5±2.7* 38.8±2.6* 43.1±3.4* 57.5±4.1*补肾组 8/7 21.6±1.9＊△# 19.1±3.2＊△ 36.1±2.5＊△# 46.8±4.9＊△ 56.4±3.1＊△# 70.3±4.7＊△调肝组 8/9 18.9±2.3＊△ 34.8±2.7＊△▲ 31.5±2.4＊△ 50.2±3.0＊△▲ 50.1±4.2＊△ 79.5±3.9＊△▲调理肝肾组 9/8 21.7±1.8＊△# 39.0±2.1＊△▲ 36.3±2.2＊△# 55.9±3.1＊△▲ 56.3±3.8＊△# 87.8±6.1＊△▲

4 讨论

女子月经周期子宫内膜有着从增殖、分泌到崩解修复的特征性变化，并参考国内外有关研究［3－5］建立的小鼠月经模型，观察子宫内膜的形态和功能变化以及影响的因素，可以进一步阐明月经的生理、病理机制，由此研究增殖期和分泌期的子宫内膜变化以及影响因素尤为重要。研究发现，此小鼠月经模型在组织学上显示出与人类子宫内膜的周期性变化类似的特征，即在单纯雌激素作用时与人类增殖期内膜上皮细胞相似;雌、孕激素联合作用时，则与人类中晚分泌期子宫内膜的特征相似。［7］

补肾方以金匮肾气丸加减化裁而成，方中熟地黄、枸杞子滋补肝肾之阴，山药补脾涩精，以助滋补肾中之阴，巴戟天、沙苑子、肉桂温补肾中之阳，生少火以助肾气，加泽泻可补中寓泻，补而不滞，纵观全方则温补肾阳而不燥、滋补肾阴而不腻，阴阳双补。调肝方则以逍遥散加减化裁，此方在妇科疾病应用颇多，［8］方中当归、白芍滋养肝血，柴胡、香附、玫瑰花疏肝理气，辅以茯苓、白术培补脾土，滋气血生化之源，兼能养肝调肝。如此配伍则补肝体、助肝用，气血兼顾。现代研究补肾药、调肝药有类似激素样调节作用。［9－11］

本研究一方面通过切除小鼠卵巢来阻断内源性激素的干扰，另一方面则在定量激素替代的基础上给予中药复方干预，并采用子宫湿重与体质量的比值作为检测中药激素活性的方法，［10］加之血清中激素含量的测定，子宫内膜组织中相应激素受体表达的测定进行综合验证。结果提示:各给药组与模型组比较均增加了血清中的雌、孕激素含量，但差异无显著性。这也说明了中药的激素样作用是比较缓和的，且激素的生物学效应发挥主要是与其受体的亲和性有关，与文献研究相一致。［10］在T1 点，即雌激素调控的增殖期，补肾组与调理肝肾组小鼠子宫组织中ER－α、PR、VEGF 的表达均显著上调;在T2 点，即雌、孕激素联合调控的分泌期，调肝组与调理肝肾组小鼠ER－α、PR、VEGF 的表达均显著上调。

综上，激素受体的表达水平决定了相应激素的生物学效应，雌、孕激素与其受体的亲和性以及血管发生关键因素［12］的变化影响到了子宫内膜的形态和功能，故根据子宫内膜增殖期、分泌期采用不同方药进行调节彰显了中医辨病与辨证相结合，以及因时制宜的特色。本研究也提示，在雌激素调控的增殖期，补肾滋肾较宜;在雌、孕激素共同调控的分泌期，则宜疏肝养肝。调理肝肾按月经周期用药更适合调整子宫内膜的状态和功能，这也是我们将来进一步研究的重点。

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