消痰化瘀中药对NAFLD大鼠LXRα mRNA和ABCA1表达的影响*

河北中医学院 (石家庄050200)

张一昕 邓国兴 吴中秋 于文涛 徐 晶 韩 雪 潘思彤

研究表明，肝X 受体(LXRs)对胆固醇的吸收、输出、转运和分泌等诸多过程具有调控作用，LXRs 信号通路在非酒精性脂肪肝(NAFLD)的发生和发展中具有重要的作用，并有望成为治疗NAFLD 的重要靶点。［1］ATP 结合盒转运蛋白A1(ABCA1)是LXRs 的靶基因，是一种重要的胆固醇流出调节蛋白。［2］前期临床研究表明，消痰化瘀中药具有良好的调节血脂和治疗NAFLD 作用。［3］为了进一步探讨其作用机制，笔者观察了消痰化瘀中药对模型大鼠LXRα 和ABCA1 表达的影响。

1 实验材料

1.1 实验动物 SD 大鼠60 只，雄性，清洁级，体质量180±20 g，购于河北省实验动物中心，合格证号:1403039。

1.2 实验用药 消痰化瘀中药由制半夏、建泽泻、海藻、丹参、温郁金、醋柴胡、生大黄、决明子、炒白术、生黄芪等组成，购自石家庄乐仁堂医药股份有限公司，水煎至所需浓度的溶液。东宝肝泰片(批号:H22024764)，通化东宝药业股份有限公司生产，用羧甲基纤维素钠配制成符合要求的混悬液。

1.3 实验试剂 甘油三酯 (TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白 (HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、游离脂肪酸(FFA)试剂盒均购于北京中生生物工程高技术公司，一抗ERK1 兔抗IgG 多克隆抗体和二抗山羊抗兔购自武汉博士德生物技术有限公司，SP9001 试剂盒及DAB 显色剂购自北京中山生物技术有限公司，Trizol 购自Invitrogen 公司，DEPC 购自Sigma 公司，RT Reagents、PCR Reagents、DNA Marker 购自TaKaRa 公司。

1.4 主要仪器 Humalyzer2000 半自动生化分析仪、高速冷冻离心机、VANOX AHB－LB 型OLYMPUS 万能显微镜、PE9600 型PCR 扩增仪、Motic6.0 数码医学图象分析系统、凝胶图象分析系统(法国VL 公司BIO－PROFIF)等。

2 实验方法

2.1 动物造模与分组 随机将SD 大鼠60 只分为6 组，每组10 只，分别是正常组、模型组、阳性药(东宝肝泰)对照组和消痰化瘀中药高剂量组、中剂量组、低剂量组。正常组喂养给予一般饲料，其余各组参照文献报道的方法［4］喂饲高脂饲料(胆固醇、猪油、猪胆酸钠、甲基硫氧嘧啶、普通饲料的比例分别为1.5%、10.0%、0.5%、0.2%、87.8%)造模。

2.2 给药方法 自大鼠喂饲高脂饲料的同时即给予相应的药物灌胃，对照组东宝肝泰和消痰化瘀中药高、中、低剂量组的给药剂量标准分别为:0.90、43.34、32.50、21.67 g/kg，正常组、模型组均灌服和治疗组同容量的蒸馏水，每天给实验大鼠灌胃给药1 次，各实验组每次给药采用相同体积，均按照1 mL/100 g 的标准实施，共用药8 周。

2.3 标本采集方法 实验大鼠最后1 次灌胃后，禁食12 h，然后麻醉，分离股动脉并取血，分离血清用于血脂检测;取血后立即打开腹部、取出肝脏，先取少许肝组织迅速置于冷冻管中液氮保存，用于RT－PCR 法检测;再取少许肝组织置于冰箱中冷冻保存，用于肝内脂质含量测定;同时取适宜大小的肝和小肠组织，4%多聚甲醛溶液固定，用于HE 染色和免疫组化观察。

2.4 检测方法

2.4.1 血脂和肝内脂质测定:血清TG、TC、HDL、LDL 和FFA 的含量以比色法用半自动生化分析仪测定;称取冷冻的肝组织，制成10%的匀浆，吸取上清液，用722 型光栅分光光度计检测TC 和TG 的含量。

2.4.2 肝组织病理学观察:将固定的肝组织，常规HE 方法染色，镜下观察肝细胞的大小、形态、排列和肝细胞脂肪变性等。

2.4.3 免疫组化法观察小肠组织中ABCA1 的表达:取固定的小肠组织，常规脱水、包埋、切片，采用免疫组织化学方法运用光镜观察，阳性表达的标准:呈现黄棕色粗颗粒或细腻颗粒分布。肝组织的阳性表达弥散在肝细胞内，小肠组织的阳性表达在细胞浆内。运用Motic Med 6.0 数码医学图像分析系统，在相同的放大倍数下，每张切片随机选取6 个不同的视野进行计数，抗原表达数值以阳性细胞染色的平均光密度值(OD)值来表示。

2.4.4 RT－PCR 法检测肝脏LXRα mRNA 的表达:采用Trizol 一步法提取总RNA。引物序列由primer 5.0 软件设计。GAPDH:上游引物5＇－TCCT GACC CTGA AGTA CCCC ATTG－3 ＇;下游引物5＇－GGAA CCGC TCAT TGCC GATA GT－3 ＇扩增片段为576bp。LXRα:上游引物5＇－ACAA CCCT GGGA GTGA GAG－3＇;下游引物5＇－TAGC ATCC GTGG GAAC AT－3＇，扩增片段为308bp。应用RT－PCR 方法检测，实验重复3 次，以GAPDH 作为内对照，计算相对含量。

3 结果

3.1 消痰化瘀中药对大鼠血脂的影响 模型组大鼠血清TC、TG、LDL－C 和FFA 的含量高于正常组(P＜0.01)，而HDL－C 的含量则低于正常组(P＜0.01)。各用药组大鼠血清TC、TG、LDL－C 和FFA 的含量均低于模型组 (P＜0.01)，HDL－C 的含量高于模型组(P＜0.01);其中消痰化瘀中药高、中、低剂量组TC、TG、LDL－C和FFA 的含量均低于阳性药组(P＜0.05 或P＜0.01)。结果见表1、表2。

表1 各组大鼠血清TG、TC、HDL 与LDL 的组间比较 (n=10，±s，mmol/L)

表1 各组大鼠血清TG、TC、HDL 与LDL 的组间比较 (n=10，±s，mmol/L)

注:与模型组比较，* P＜0.01;与对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.001;与低剂量组比较，▲P＜0.05;与中剂量组比较，■P＜0.05

分组TC TG HDL LDL正常组 1.371±0.196* 0.512±0.093* 1.119±0.186* 0.440±0.050*模型组 3.298±0.256 1.180±0.153 0.719±0.098 2.743±0.466阳性药对照组 2.131±0.352* 0.827±0.109* 1.123±0.131* 1.593±0.313*消痰化瘀高剂量组 1.484±0.239＊△△▲ 0.554±0.098＊△△▲ 1.480±0.219＊△△▲■ 0.885±0.181＊△△▲■消痰化瘀中剂量组 1.690±0.271＊△△ 0.574±0.093＊△△▲ 1.296±0.228＊△ 1.095±0.266＊△▲消痰化瘀小剂量组 0.669±0.105＊△△ 0.741±0.269＊△△ 1.305±0.233＊△ 1.215±0.289*

3.2 消痰化瘀中药对大鼠肝组织TC、TG 含量的影响 模型组大鼠肝组织TC、TG 的含量高于正常组(P＜0.01);各用药组大鼠肝组织TC、TG 的含量均低于模型组(P＜0.01)，其中，消痰化瘀中药高、中、低3 个剂量组肝组织TC、TG 的含量均低于对照组(P＜0.05 或P＜0.01)。结果见表2。

表2 各组大鼠血清FFA 和肝组织TC、TG 的组间比较 (n=10，±s)

表2 各组大鼠血清FFA 和肝组织TC、TG 的组间比较 (n=10，±s)

注:与模型组比较，* P＜0.01;与对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01;与高剂量组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01;与中剂量组比较，■P＜0.05

分组 FFA (μmol/L) TC (mmol/L) TG (mmol/L)正常组 243.335±50.284* 6.129±0.843* 21.280±3.031*模型组 436.481±52.151 15.982±2.366 36.979±4.283对照组 324.050±56.061* 10.946±1.871* 29.591±4.376*消痰化瘀高剂量组 242.191±35.130＊△△ 7.145±0.819＊△△ 23.650±3.276＊△△消痰化瘀中剂量组 259.780±29.330＊△△ 8.592±0.948＊△▲ 24.409±3.150＊△△消痰化瘀小剂量组 277.622±34.284＊△▲ 9.963±1.044＊▲▲■ 26.368±3.598＊▲

3.3 消痰化瘀中药对大鼠肝组织病理学的影响正常组大鼠的肝细胞排列规整、在中央静脉周围呈放射形状，肝窦清晰可见，胞核形态、大小正常，胞浆分布均匀。模型组大鼠肝细胞排列严重紊乱，肝窦明显扩大，细胞体积增大、形状不规则，胞浆中可见大小不一、数目不等的脂肪空泡，胞核被挤向一侧，呈现明显的脂肪变性。消痰化瘀中药各治疗组大鼠肝细胞脂滴数量和空泡明显减少，肝小叶和肝血窦的结构比较清晰，肝脂变程度均见明显改善。

3.4 消痰化瘀中药对大鼠肝脏LXRα mRNA 表达的影响 模型组大鼠肝脏LXRα mRNA 的表达明显高于正常组(P＜0.01);各治疗组肝脏LXRα mRNA 的表达水平均明显降低(P＜0.01)。结果见表3。

3.5 消痰化瘀中药对大鼠小肠组织ABCA1 表达的影响 半定量分析结果可见:模型组与正常组比较，小肠组织中ABCA1 蛋白表达量明显降低(P＜0.01)，各用药组均显著增加大鼠小肠组织ABCA1 的蛋白表达量(P＜0.01)。结果见表3。

表3 各组大鼠肝组织LXRα mRNA 和小肠组织ABCA1 表达的组间比较 (n=6，±s)

表3 各组大鼠肝组织LXRα mRNA 和小肠组织ABCA1 表达的组间比较 (n=6，±s)

注:与模型组比较，* P＜0.01;与对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01;与高剂量组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01;与中剂量组比较，■P＜0.05

分组 LXRα ABCA1正常组 0.426±0.056* 0.436±0.033*模型组 1.337±0.216 0.166±0.019对照组 0.772±0.052* 0.261±0.035*消痰化瘀高剂量组 0.537±0.059＊△△ 0.416±0.053＊△△消痰化瘀中剂量组 0.605±0.072＊△△▲ 0.325±0.048＊△△▲消痰化瘀小剂量组 0.691±0.083＊△▲▲■ 0.308±0.041＊△▲▲

4 讨论

NAFLD 是一种隐匿性肝病，已成为发达国家第一大肝病，但其确切的发病机制尚不十分明确，目前认为脂质代谢异常、胰岛素抵抗、氧应激及脂质过氧化、免疫反应损害等因素均可能参与NAFLD 的发病。现在比较接受的是Day［5］提出的二次打击学说，初次打击主要是脂质代谢紊乱及胰岛素抵抗，导致肝细胞脂肪蓄积，引起单纯性脂肪肝;二次打击主要是氧化应激及炎症因子的浸润，从而引起脂肪性肝炎和肝纤维化。由此可见脂质代谢异常是NAFLD 发病机制中最关键也是最基础的环节之一。

LXRs 是氧化性固醇激活的核受体超家族成员，LXRα 是LXRs 的亚型，LXRα 被称为胆固醇的感受器，与肌体脂质代谢密切相关，在肝脏高表达。ABCA1 是LXRs 的靶基因之一。LXR 被激活后，ABCA1、ABCG1 基因表达增强，促进体内胆固醇从肠的上皮细胞中转运至肠腔，从而抑制胆固醇的吸收;同时，促使巨噬细胞中的胆固醇向血液中的排放量进一步增加，进入血中的胆固醇由HDL 再转运回肝，最后以胆汁酸或者游离胆固醇的形式排出体外。［6－7］而且，肠上皮细胞内的胆固醇排入肠腔的量也随ABCG1、ABCA1 的表达增强而增加，最终随粪便排出体外。［8］

消痰化瘀中药为笔者经过临床反复筛选组成的治疗NAFLD 有效方药，选用制泽泻、半夏利水除湿、消散痰浊;丹参、郁金活血通络;生大黄泻腑导滞，降浊祛脂;生山楂活血祛瘀，降脂;柴胡、决明子疏利肝胆，并能降脂;黄芪、炒白术益气健脾，以助痰浊瘀血的运除。诸药配用，具有消痰祛浊，活血化瘀之功。上述药物作用于高脂饮食诱导的NAFLD 大鼠后发现，消痰化瘀中药能够显著降低血清TG、TC、HDL、LDL、FFA 和和肝组织TC、TG 的含量;减轻肝脏脂肪变性的程度;促进肝组织LXRα mRNA 及小肠组织ABCA1 的表达。研究结果提示，消痰化瘀中药对NAFLD 的治疗作用可能是通过对LXRα/ABCA1 这一通路的调控来改善脂代谢紊乱而实现的。

［1］刘渊，马雄.肝脏X 受体及非酒精性脂肪性肝病［J］.肝脏，2009，14 (5):412－414

［2］张晓菲，谭晓华，杨坤.ABCA1 在胆固醇逆转运中作用的研究进展［J］.健康研究，2010，30 (3):214－217

［3］刘连臣，徐晶，梁晓莉，等.消痰化瘀法治疗痰瘀互结型高脂血症52 例临床观察［J］.河北中医药学报，2013，28(3):20－21

［4］戴宁，曾民德，李继强，等．复方中药抑制非酒精性脂肪肝肝细胞色素P450ⅡE1 表达的实验研究［J］．中国中西医结合杂志，2000，20 (6):453－455

［5］Day CP.Non－alcoholic fatty liver disease:Current concepts and management strategies ［J］.Clin Med，2006，6 (1):19－25

［6］Gelissen IC，Harris M，Rye KA，et al.ABCA1 and ABCG1 synergize to mediate cholesterol export to ApoA2I［J］.JArterioscler Thromb Vasc Biol，2006，26 (3):534－540

［7］Matsuura F，Wang N，Chen WG，et al.HDL from CETP2 deficient subjects shows enhanced ability to promote cholesterol efflux from macrophages in an apoE2and ABCG12 dependent pathway［J］.J Clin Invest，2006，116 (5):1 435－1 442

［8］Klucken J，Buchler C，Orso E，et al.ABCG1 (ABC8)，the human homolog of the Drosophila whie gene is a regulator of macrophage cholesterol and phospholipids transport ［J］.J Proc Natl Acad Sci USA，2000，97 (2):817－822