云南球花石斛提取物体外自由基清除活性研究

张凯丽，翁瑞旋，李 双，王 赟，张桂花，李玉鹏*

（1.昆明医科大学药学院/云南省天然药物药理重点实验室，云南 昆明 650500；2.中国科学院上海药物研究所，上海 201203）

云南球花石斛提取物体外自由基清除活性研究

张凯丽1，2，翁瑞旋1，李 双1，王 赟1，张桂花1，李玉鹏1*

（1.昆明医科大学药学院/云南省天然药物药理重点实验室，云南 昆明 650500；2.中国科学院上海药物研究所，上海 201203）

采用DPPH自由基清除法对云南球花石斛（Dendrobium thyrsiflorum） 95%乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇5种提取物的体外自由基的清除作用进行研究。试验结果表明，球花石斛乙酸乙酯粗提物的自由基清除效果最显著，其IC50为0.11 mg/mL。球花石斛提取物在抗氧化方面有一定的应用价值，该研究工作对球花石斛的开发应用提供了科学依据。

球花石斛；药用植物；自由基清除活性

石斛是常用名贵中药材，为兰科（Orchidaceae）石斛属（Dendrobium Sw.）多种植物的新鲜或干燥茎的统称。在中国76种石斛属植物中有30多种作药用。在《神农本草经》中，石斛被列为上品，具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳、明目强身等功效［1］。球花石斛［2］（Dendrobium thyrsiflorum Rchb.f）为兰科石斛属（Dendrobium Sw）多年生草本植物，附生于海拔1 100～1 800 m的山地林中树干上。分布于云南南部至西南部，印度东北部、缅甸、泰国、老挝、越南亦产。为满足石斛商品市场的需要，于1998年被收入江苏省药材标准。从球花石斛分得联苄、菲类、芴酮、香豆素和多糖等类型的化学成分［3～11］。为了开发和应用该药用植物，寻找到该植物药用物质基础，在对云南产束花石斛体外抗氧化活性研究的基础上［12］，笔者对云南产球花石斛体外自由基清除活性进行研究。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

仪器：722 s型可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；旋转蒸发仪（日本东京理化），FA 2004型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）。试剂：DPPH（1，1-二苯基-2-苦基肼自由基，Sigma-Fluka公司产品）；芦丁对照品（中国医药集团贵州生物试剂公司）；95%乙醇（分析纯，天津化学试剂有限公司），其它试剂均为国产分析纯。

1.2 植物来源

球花石斛于2013年5月15日采自云南思茅，标本保存于昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室。

1.3 提取与分离

球花石斛0.30 kg，用95%乙醇提取5次，减压回收至无乙醇味，得乙醇提取物41.0 g。乙醇提取物用水溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇进行萃取，减压浓缩后分别得到石油醚5.0 g、乙酸乙酯5.5 g、正丁醇9.5 g、甲醇13.0 g 5个部分，乙醇提取物和萃取的各部分分别取20 mg进行体外自由基清除活性测试。

1.4 自由基清除活性测定

1.4.1 DPPH液的配制

准确称取DPPH试剂25 mg，用95%分析纯的乙醇溶解，并定量转入250 mL容量瓶中，用95%乙醇定容，摇匀，得质量浓度为100 mg/L的DPPH储备液，置于冰箱中冷藏备用。

1.4.2 样品溶液的配制

准确称取待测试样品20 mg，溶解在分析纯的乙醇中，并转入100 mL容量瓶中，用乙醇定容，摇匀，得质量浓度为200 mg/L的样品溶液，置于冰箱中冷藏备用。

1.4.3 芦丁标准溶液的配制

准确称取芦丁2.5 mg，溶解在分析纯的乙醇中，并转入100 mL容量瓶中，用乙醇定容，摇匀，得质量浓度为25 mg/L的样品溶液，置于冰箱中冷藏。

1.4.4 清除DPPH自由基能力的测定

准确量取1.2 mL DPPH液，加入2.8 mL 95%乙醇溶液，混匀，在λ=520 nm测吸光度作为Ac值，自由基清除率为零。分别准确量取各样品溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL，加入1.2 mL DPPH液及2.6 mL、2.4 mL、2.2 mL、2.0 mL、1.8 mL、1.6 mL、1.4 mL、1.2 mL的95%乙醇溶液混合均匀，在λ=520 nm测吸光度作为Ai值。另外分别准确量取各样品溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL，加入3.8 mL、3.6 mL、3.4 mL、3.2 mL、3.0 mL、2.8 mL、2.6 mL、2.4 mL的95%乙醇溶液后混合均匀，在λ=520 nm测吸光度作为空白校正Aj值。以芦丁作为阳性对照。按下式计算自由基清除率K值。

K（%）＝［1-（Ai-Aj）/Ac］×100

2 结果与分析

表1结果显示，球花石斛乙醇提取物及其不同溶剂萃取部分对DPPH自由基的清除率随着量的加大有逐步增强的趋势；但不同提取物自由基清除作用差别较大，乙酸乙酯萃取部分相对其它提取物清除率略高。

从表2中可看出，球花石斛的乙醇粗提物、乙酸乙酯提取物对DPPH自由基清除活性IC50值比其它提取物的IC50值小，表现了较强的自由基清除活性，但比芦丁弱。

表1 球花石斛提取物DPPH自由基清除率

表2 球花石斛提取物清除DPPH自由基活性的IC50值

3 讨论

研究表明，球花石斛的乙酸乙酯提取物活性较好，自由基清除IC50为0.11 mg/mL，进一步研究该部分化学成分，可能得到自由基清除活性较强的化合物。笔者首次用DPPH自由基清除活性研究方法对球花石斛不同溶剂提取物自由基清除活性进行研究，该研究为其研究开发和应用提供了科学依据。在此研究基础上，笔者将进一步采用新的药理活性筛选方法跟踪，分离得到新的活性成分。

［1］江苏新医学院.中药大辞典［M］.上海：上海科学技术出版社，1985.

［2］陈心启，吉占和，罗毅波.中国野生兰科植物彩色图鉴［M］.北京：科学出版社，1998，

［3］张光浓，张朝凤，王峥涛，等.球花石斛的化学成分研究［J］.中国天然药物，2004，2（2）：78-81.

［4］张光浓，张朝凤，罗英，等.球花石斛的化学成分研究［J］.中国天然药物，2005，3（5）：287-290.

［5］Wrigleyt C.Ayapin.scopoletin and 6，7-dimethoxy coumarin from Dendrobium thyrsiflorum［J］.Nature，1960，188：1108.

［6］Liu YY，Yu H，Chen YG.CHEMICALCONSTITUENTSOFDendrobiumthyrsiflorum［J］.Chemistry of Natural Compounds，2011，47（2）：275-276.

［7］Zhang GN，Zhong LY，Annie Bligh SW，et al.Bi-bicyclic and bi-tricyclic compounds from Dendrobium thyrsiflorum［J］.Phytochemistry，2005，66：1113-1120.

［8］郑艳，徐珞珊，王峥涛，等.球花石斛茎中香豆素类成分的定位与相对定量［J］.药学学报，2005，40（3）：236-240.

［9］郑艳，徐珞珊，王峥涛，等.香豆素类成分在球花石斛根中的分布和相对含量［J］.激光生物学报，2005，14（2）：87-90.

［10］张光浓，张勉，史永锋，等.HPLC-UV测定球花石斛中滨蒿内酯和泽兰内酯含量［J］.中国药学杂志，2006，41（5）：388-391.

［11］宋宁，陆瑛，邱明华.球花石斛多糖免疫调节作用的研究［J］.天然产物研究与开发，2006，18：445-448.

［12］文小玲，俆俊驹，陈丽君，等.云南药用植物束花石斛提取物体外抗氧化活性研究［J］.昆明医科大学学报，2014，35：4-5.

2014-07-14

国家自然科学基金资助项目（21202066）；云南省应用基础研究计划基金资助项目（2012FB156）；云南省教育厅科学研究基金资助项目（2013C247）；云南省天然药物药理重点实验室开放研究基金资助项目（2013G009）。

张凯丽（1991-），女，硕士研究生，主要从事天然药物化学成分和药理活性研究。

*为通讯作者：李玉鹏，男，硕士研究生导师，副教授，主要从事天然药物化学成分和药理活性研究，E-mail：liyupeng26@126.com。