不同正畸力对大鼠牙周组织改建的相关研究

常 悦, 张小平, 王明洁, 王 月, 崔淑霞

(河南 郑州 450052: 1.郑州大学第四附属医院口腔科;2. 河南省中医院口腔科; 3. 河南省口腔医院正畸科)

不同正畸力对大鼠牙周组织改建的相关研究

常 悦1, 张小平2, 王明洁1, 王 月1, 崔淑霞3

(河南 郑州 450052: 1.郑州大学第四附属医院口腔科;2. 河南省中医院口腔科; 3. 河南省口腔医院正畸科)

目的: 观察不同正畸力作用不同时间后，大鼠移动牙张力侧牙周组织中的BMP- 2表达变化及牙周组织的改建。方法: 将健康雄性Wistar大鼠60只，随机分成4组(n=15)，分别施加0 g(A组)、30 g(B组)、50 g(C组)、80 g(D组)力，建立左上第一磨牙移动模型。分别于加力后1、3、7、14、21 d，测量各组牙齿移动的距离；取实验牙——牙周组织联合切片，HE染色法观察牙周组织变化,免疫组化法检测张力侧牙周组织中BMP- 2的表达。结果: 牙齿移动以C组最大，B组次之，D组最小；HE染色显示，A组牙周组织无明显变化，B组和C组牙周组织改建活跃，张力侧可见新生的成骨细胞，D组牙周膜纤维排列混乱,并可见牙根局限性的吸收；免疫组化染色显示，BMP- 2主要分布于牙周韧带中，尤其是近牙槽骨和牙骨质的区域染色较强，各加力组BMP- 2表达水平均明显升高，并随着力值的增大而增加(P﹤0.05)，C组与D组相比，各时间点均无统计学差异(P>0.05)。结论: BMP- 2的表达与力值大小呈正相关，50 g的正畸力值促进牙周组织改建最明显。

正畸力; 大鼠; 牙槽骨改建; BMP- 2

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.09.004

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(9):529]

生理状态下牙周组织处于成骨和破骨的动态平衡之中，而在正畸力作用下牙周组织则会发生适应性改建，表现为压力侧破骨细胞增生活跃，以骨吸收为主；张力侧成骨细胞增生活跃，以骨生成为主。但在正畸治疗过程中以多大的正畸力才能安全有效的加速牙齿移动，一直是广大学者关注的课题。BMPS是转化生长因子-β(TGF- β)超家族成员，主要参与机体的成骨活动；其中BMP- 2是其家族中研究最广泛，诱导活性最强且唯一能单独诱导成骨的因子[1-2]。本实验通过建立大鼠牙齿移动模型，观察不同正畸力作用下，张力侧牙周组织中BMP- 2表达的变化，以期更深入了解成骨细胞活化的时机和机制，并为进一步探讨不同力值与牙周组织改建的关系奠定生物学基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物、材料和仪器

Wistar大鼠(河南省动物实验中心提供)；游标卡尺(桂林广陆数字测控股份)；弹簧测力计(杭州西湖生物材料)；镍钛螺旋拉簧(北京圣马特科技)；正畸用0．020 mm结扎丝(杭州森风齿科材料厂)；BMP抗体、SABC试剂盒、DAB显色试剂盒(北京中山生物技术开发)。

1.2 大鼠正畸牙移动模型的建立

1.2.1 实验动物分组

取10周龄雄性Wistar大鼠60只(体质量210～227 g)，要求牙体、牙列完整，无龋齿及牙周组织疾病；普通饲料适应性饲养(分笼)1周后，按不同正畸力值将其随机分为4组：0 g(A组)、30 g(B组)、50 g(C组)、80 g(D组)(n=15)。

1.2.2 不同正畸力值牙移动装置的安装

所有大鼠经100 mL/L水合氯醛腹腔注射麻醉并固定后，首先用牙科高速涡轮机和尖头金刚砂车针分别在各大鼠上颌的中切牙和左侧第一磨牙颈部、颊侧面及近中轴面各制备一浅凹；然后分别将0.020 mm正畸结扎丝从各大鼠的左上第一、第二磨牙的邻间隙穿过，并连接于预备好的NiTi拉簧一端备用。用正畸测力计将各组的正畸力分别调整至0、30、50、80 g后，用游标卡尺分别测量各力值所拉伸的距离；然后，另取一段结扎丝，分别与各大鼠拉簧的另一端连接，将其拉伸至相应组所设力值的长度，并固定于中切牙的固位沟内，使之以上颌两个中切牙为支抗向前移动第一磨牙；最后用树脂粘结剂覆盖结扎丝和固位沟以加强固位(图1)。牙移动装置安装后，每日检查动物口腔并测量力值以保证力值恒定，发现螺旋拉簧脱落则重新加载。为补偿螺簧应力疲劳及牙移动引起的力值衰减，每周加力1次。

图1 牙移动装置安装情况

1.3 牙移动距离的测量

分别于牙齿移动装置安装后1、3、7、14、21 d各时间点，每组各随机抽取3只大鼠，分别用40 mL/L 多聚甲醛液心内灌注处死后，分离各大鼠的左侧上颌骨，并用游标卡尺测量其上颌左侧第一磨牙远中舌沟点与第二磨牙近中舌沟点间的距离。所有测量均由同一人完成，测量精确0.01 mm，每个样本测量3次取均值。

1.4 移动牙牙周组织切片的制备

上述测量结束后，立即截取含上颌第一、第二磨牙及其周围牙槽骨的组织块，并将其置于40 mL/L 中性多聚甲醛液中固定48 h。将固定后的各组织块置于100 g/L EDTA(pH 7.4)中， 4 ℃条件下脱钙至大头针能顺利扎入牙中(4～6周)后，常规乙醇梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋；然后平行于牙体长轴，制备牙——颌骨近远中向纵切片(片厚5 μm)。

1.5 常规组织学观察

取各大鼠的牙周组织切片，常规HE染色后光镜下观察其牙周组织的变化情况，并拍照。

1.6 免疫组化染色观察各组牙周组织中BMP- 2的表达水平

取各组切片脱蜡至水化，30 mL/L过氧化氢液封闭10 min后, 1 g/L胰蛋白酶室温孵育10 min，以灭活内源性过氧化物酶；PBS冲洗2 min×3次，滴加50 μL一抗(BMP- 2抗体的1 ∶50稀释液)4 ℃过夜；PBS缓冲液(pH 7.2～7.6)洗涤10 min×3次，37 ℃ 复温1 h；滴加50 μL DAKO二抗复合物，37 ℃孵育30 min；PBS冲洗3 min×3次，DAB显色；蒸馏水冲洗，苏木素轻度复染；蒸馏水冲洗，常规脱水、透明、封片，光镜观察并拍照。

然后利用Biosens Digital Imaging Systen(上海山富科学仪器有限公司)高清晰度彩色病理图文分析系统,对每张免疫组化染色后的组织切片进行BMP- 2定量分析：以第一磨牙张力侧(远中)根中1/3处的近牙骨质侧的牙周膜为测量部位，分别从每张切片的测量部位各随机选择3个视野，计算机计算各标本该部位的平均积分光密度值(IOD)。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 不同力值组大鼠的牙移动距离比较

牙移动距离测量结果显示，各组牙移动周期均符合3个阶段：①瞬时运动阶段(1～7 d); ②迟滞期(7～14 d); ③加速移动阶段(14～21 d)。各组各时间点的牙移动距离均以C组最大(1 d时除外); B组次之，D组最小；B组与C组相比在7、14、21 d时差异均有统计学意义(P<0.05)，B组与D组相比在1、3、7、14 d时差异均有统计学意义(P<0.05); C组与D组相比在1、3、7、14、21 d差异具有统计学意义(P<0.05)(表1)。

表1 不同力值组大鼠牙移动距离比较

2.2 HE染色观察结果

A组各时间点的牙周膜近远中间隙均等宽，且胶原纤维排列规则，破骨细胞少见(图2a)。B组压力侧牙周膜变窄，牙槽骨边缘可见少量的骨吸收陷窝和破骨细胞(图2b)。C组牙周组织反应活跃,牙周胶原纤维排列不规则，牙槽骨边缘可见大量的骨吸收陷窝和破骨细胞；张力侧牙周膜间隙增宽，血管扩张，新生的成骨细胞沿牙槽骨侧排列(图2c)。D组压力侧牙周膜纤维排列混乱，有明显的牙槽骨和牙骨质的吸收，破骨细胞少见；张力侧牙周纤维断裂，新生的成骨细胞和成牙骨质细胞少见(图2d)。

2.3 各组牙周组织中BMP- 2的定性、定量分析

正常对照组(A组)牙周组织中的BMP- 2主要分布于牙周膜及其周围组织细胞的胞质中，尤其是邻近牙槽骨和牙骨质的区域阳性染色较强，成骨细胞和成纤维细胞染色均为阳性(图3a)；其张力侧牙周组织中的BMP-2在各时间点的表达均无明显变化(表2)。B组随着加力时间的延长张力侧BMP- 2阳性细胞数目逐渐增多，且染色加深，7 d时达到高峰(图3b)，14 d开始逐渐下降，21 d接近正常组水平；其平均IOD与A组相比，在3、7、14、21 d各时间均有统计学差异(P<0.05)(表2)。C组张力侧BMP- 2阳性细胞数目明显增多(图3c)，其平均IOD与A组相比，在各时间点均有统计学差异(P﹤0.05)，而与B组相比，在1、3、7、14 d各时间点均无统计学差异(P>0.05)；21 d时其平均IOD仍处于较高水平，与B组相比差异有统计学意义(P<0.05)(表2)。D组张力侧BMP- 2染色加深(图3d)，其平均IOD与A组相比，各时间点均有统计学差异(P﹤0.05)；与B组相比，在1、7、14、21 d各时间点均有统计学差异(P<0.05)；而与C组相比，各时间点均无统计学差异(P>0.05)(表2)。

表2 不同力值组张力侧牙周膜中 BMP- 2的IOD值比较

不同字母组间P﹤0.05

图2 各组牙周组织HE染色观察(10×40)

图3 各组张力侧牙周组织中BMP- 2的表达和分布(10×40)

3 讨论

正畸力适当与否是正畸牙齿移动的关键因素，King等[3]分别以20、40、60 g的正畸力对大鼠的牙齿进行移动时发现， 40～60 g是正畸牙齿移动的适当力值范围，可以观察到特征性的牙齿移动及相关骨改建的过程。燕滨漪等[4]报道，对大鼠的磨牙施加80～100 g的力时，其压力侧出现了广泛的透明样变，并伴有潜行性骨吸收，且牙移动缓慢。因此本实验分别选用小力值(30 g)、中力值(50 g)、大力值(80 g)来研究大鼠牙周组织的变化情况。

在正畸过程中，牙齿移动会伴随着牙槽骨的改建，因此动物实验常以牙移动速度来动态的反映骨改建的情况。本实验中牙齿移动距离显示，各组 1～7 d 时的牙齿移动距离有明显差异，即B组(30 g)和C组(50 g)的牙齿移动快，说明其牙周组织改建活跃，从而导致了牙槽骨表面直接骨吸收，使其牙齿移动距离较大; 7～14 d时各组牙齿移动速度较慢。组织学观察显示：压力侧血管压缩、血流受阻，在牙周膜内出现玻璃样变结构，牙槽骨改建停滞(图2b)；其中D组(80 g)的牙齿移动距离最小，压力侧牙周组织中破骨细胞较少，压力侧根中部可见牙骨质的吸收, 牙槽骨表面出现不规则的破骨陷窝，且以潜掘性吸收为主(图2d)。这可能是由于力值过大，牙槽骨改建受到抑制的缘故。14～21 d时，B组和C组的牙齿移动距离增大，说明其进入了进行性牙齿移动阶段，其中C组移动距离最大，说明其牙周组织改建活跃，并提示该力值(50 g)是牙槽骨改建的最适力值；而D组的牙齿移动基本停滞，可能因为其牙周受损仍然严重，只有待变性的牙周组织完全清除后，牙齿才能移动，所以牙齿移动缓慢。

BMP- 2是较强的成骨细胞因子,参与BMP-Smad信号传导通路[5]，在体内可通过自分泌和旁分泌的方式促进骨、软骨等相关结缔组织的形成[6-7]。有研究发现，BMP- 2在张力侧牙周韧带(PDL)中，尤其在PDL新生的牙骨质和牙槽骨附近染色较强，在牙槽骨外侧骨板和牙槽嵴附近也有BMP- 2的表达，并与PDL中BMP- 2区相连系；提示，BMP- 2与牙槽骨的改建有很大的联系[8-9]。本结果显示：A组张力侧牙周组织中BMP- 2染色较浅，可能与未加力状态下，牙周组织自分泌形式维持其稳态有关；B组BMP- 2 IOD在各加力组中相对较低，说明其对张力侧牙周膜及牙槽骨中的成骨细胞和成纤维细胞的激活能力低，从而使牙槽骨改建不活跃；C组BMP- 2 IOD较B组有所增高特别在加力1 d和21 d时，与B组相比差异具有统计学意义，说明C组牙周组织改建活跃，该力值能促进张力侧成骨细胞和成纤维细胞的增殖和分化；D组BMP- 2 IOD与对照组相比差异显著并呈增加趋势，但与C组相比各时间点的差异均无统计学意义，可能是D组牙周组织破坏严重，牙槽骨改建延迟的缘故。本实验中BMP- 2表达水平的最高峰出现在加力的第7 d，而陈远萍等[10]报道，BMP- 2表达的最高峰出现在加力的第5 d, 其原因可能是由于本实验以整个正畸疗程为1个周期，未将5 d纳入到此周期范围，因而高峰出现在第7天，但BMP- 2的变化趋势与其研究的结果相一致。

Frost的机械阈值理论认为，如果应变量很小，骨代谢则处于负平衡状态，以骨吸收为主，从而导致骨量丢失；如应变量增加，骨代谢则进入正平衡状态，骨沉积增加；如应变量继续增大且超过一定界限，则骨代谢又表现为负平衡，骨组织中会出现微小损伤，并且修复的速度不能赶上损伤的速度，从而导致骨量减少。本结果与上述理论相一致，即：30 g力时应变量很小，骨代谢处于负平衡状态，以骨吸收为主，表现为成骨活动不活跃，牙槽骨改建缓慢；50 g力时，应变量增加，骨代谢进入正的平衡状态，以骨沉积为主，表现为成骨活动活跃，牙槽骨改建较快; 80 g力时, 超过牙周膜改建的最适力值，牙周组织破坏严重，从而使骨代谢进入负平衡状态，表现为成骨和破骨活动均不活跃，牙槽骨改建停滞，骨量减少。本实验通过观察不同力值作用不同时间后，BMP- 2 在移动牙张力侧牙周组织中的表达情况，了解了不同力值对于大鼠牙周组织改建的影响。结果提示，在正畸过程中关闭拔牙间隙时，并不是力值越大越好，力值过大反而抑制了牙齿的移动，其中以50 g的力值最佳,既利于牙槽骨改建又可提高牙齿移动的效能。但这只是初步阶段，如何利用BMP- 2促进成骨的特性，将其用于正畸临床中以加速牙齿移动，并改善牙周病患者正畸治疗的风险，还有待更深入的研究。

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The related study of the effect of different orthodontic force on the rebuilding of periodontal tissue in rats

CHANG Yue*, ZHANG Xiao- ping, WANG Ming- jie, Wang Yue, CUI Shu- xia

(*DepartmemtofOrthodontics,theForthAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

AIM: To investigate the effect of different orthodontic force on BMP- 2 expression in the tension side of periodontal tissues of rat during orthodontic tooth movement. METHODS：60 healthy rats were randomly divided into 4 groups (n=15) and were subjected to different orthodontic forces：group A (0 g), group B (30 g), group C (50 g) and group D (80 g). The distance of orthodontic tooth movement was determined after adding the forces for 1, 3, 7, 14 and 21 d, respectively. Then the rats were executed and the periodontal tissue of the maxiallary first molars were observed by HE staining. The expression of BMP- 2 in periodontal tissue in the tension side was determined by immunohistochemical method. RESULTS: The distances of orthodontic tooth movement were as in following order: group C>B>D>A. HE staining r showed that there were no significant changes in the periodontal tissue in group A. The periodontal tissue rebuilt in groups B and C was active and osteoblasts were more in the tension side of the periodontal tissue. While in group D, periodontal ligament fibers were in disorder and root resorption was observed . Immunohistochemical staining showed that BMP- 2 was mainly distributed in periodontal ligament, especially in alveolar bone and cementum region, With the increase of orthodontic force, the expression of BMP- 2 increased (P﹤0.05). No statistically significant difference was observed between group C and group D. CONCLUSION: The expression of BMP- 2 is highly related with the orthodontic force strength. 50 g orthodontic force can promote periodontal tissue remodeling.

orthodontic force; rat; alveolar bone remodeling; BMP- 2

2015-01-11

省教育厅重点项目(13A320625)

常 悦(1987-),女，汉族，河南郑州人。硕士

崔淑霞，E-mai:cui-shuxia@163.com

R783.5

A

1005-2593(2015)09-0529-05