亲环素A在人根尖周炎中的表达与临床表现的相关性研究

王艳青, 胡菊花, 李 颂, 胡淑丽, 张红艳

(安徽 合肥 230032：1.安徽医科大学口腔医学院;2.安徽医科大学附属口腔医院，安徽省口腔疾病研究中心实验室)

亲环素A在人根尖周炎中的表达与临床表现的相关性研究

王艳青1, 胡菊花2, 李 颂2, 胡淑丽2, 张红艳1

(安徽 合肥 230032：1.安徽医科大学口腔医学院;2.安徽医科大学附属口腔医院，安徽省口腔疾病研究中心实验室)

目的: 初步探讨人根尖周炎中亲环素A(CypA)表达及与临床表现的关系。方法：收集根尖手术切除并经病理诊断证实的根尖周炎病损组织83例作为实验组；收集新鲜拔除的健康正畸牙牙髓6例作为正常对照组。用免疫组织化学染色法分析比较各组织中CypA及RANKL的表达情况，取蛋白平均吸光度值(A值)进行统计学分析，并比较其表达量与临床症状的相关性。结果：根尖周炎病变组织中CypA主要表达于炎细胞浸润区和上皮组织，主要阳性细胞为淋巴样细胞、上皮细胞、血管内皮细胞，正常对照组中少见CypA的表达；CypA在根尖肉芽肿组织中的表达量明显高于根尖囊肿组(P<0.05)，RANKL在根尖囊肿组织中的表达量明显高于根尖肉芽肿组(P<0.05)；有明显临床症状的根尖周炎组织中CypA和RANKL的A值均明显高于无症状组(P<0.05)；CypA和RANKL的表达水平与根尖周炎病变大小均呈正相关(r=0.462，P<0.05；r=0.417，P<0.05)。结论：CypA存在于人根尖周炎病损组织中,可能参与人根尖周炎疾病的发病进程。

亲环素A; RANKL; 根尖周炎; 临床表现

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.02.003

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(2): 73]

根尖周炎主要是一种多数继发于根管牙髓感染、以持续的抗原刺激引起宿主反应和根尖部牙槽骨组织破坏为主要特征的牙体牙髓疾病[1-2]。这个免疫反应是复杂的，它包括招募多种炎性细胞并形成多种细胞因子来参与一个广泛的免疫反应网络。有研究表明，在机体对细菌及其产物的免疫反应中，会合成一些促炎细胞因子来诱导和维持炎症反应[3-5]。但根尖周病的具体发病机制目前仍不十分明朗。

亲环素A(CypA)是人类细胞内蛋白亲环素族中最丰富的一种，在动脉粥样硬化中、炎性和氧化应激反应中可由单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞分泌[6-7]；其可在炎性条件中由细胞胞外释放，也可以通过与细胞外基质中的金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)结合来调节炎性反应[8-9]。最近，在对很多种疾病的研究中都在关注亲环素A在其发展中的潜在作用，其中包括类风湿性关节炎、肿瘤和心血管疾病等[10-12]。已有研究证明，亲环素A参与人类牙周病和实验性小鼠牙周病的发病过程[13-14]。但在根尖周炎中仍没有该因子的相关报道。

本实验旨在检验亲环素A是否存在于人类根尖周病中，并通过比较根尖周炎病损组织中亲环素A和RANKL(Receptor activator of NF KappaB Ligand)的表达情况以探讨其与骨破坏的关系；同时结合不同临床表现讨论亲环素A在根尖周病中的可能作用。

1 材料和方法

1.1 主要仪器与试剂

Olympus CX21FS1型光学显微镜(奥林巴斯，日本)；Spot Advanced显微摄像系统(Diagnostic Instrument Inc，美国)；Image- Pro- Plus 6.0图像处理系统(Media Cybemetics Inc，美国)；隔水式恒温培养箱(GNP- 9160型,上海三发科学仪器有限公司)；电热恒温鼓风干燥箱(DHG- 9140A型,上海精宏实验设备有限公司)；微波炉(PJ21C- AU型, 广东美的集团)；-20 ℃冰箱(BCD- 209KHC型, 安徽美菱股份有限公司)；Nikon生物显微镜(E200型，日本)；病理组织包埋机(BM- 2型, 上海同舸医疗器械有限公司)；LEICA组织切片机(RMZ125型，德国)；SP通用型试剂盒(streptavidin- perosidas，链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法；福建迈新生物技术有限公司)；DAB显色液(武汉博士德生物技术有限公司)；兔抗人CYPA抗体(ab154388，abcam, 美国)RANKL抗体(Santa Cruz Biotechnology, CA)。

1.2 方法

1.2.1 样本收集和组织切片制备

收集我院颌面外科2014-01—2014-07经根尖手术切除的根尖周炎病损组织83例，其中男42人，女41人。纳入标准：①年龄18～65岁；②无其他口腔疾病和全身性疾病；③3个月内未服用抗生素和其他激素类药物。同时收集患者相关信息，包括临床表现和根尖片(平行线投照技术[15])；并根据有无疼痛、肿胀等明显临床症状将其分为有症状组和无症状组。然后，由两位不知本试验目的的实验员使用医用软件(clinview 8.2)测量根尖稀疏区的直径并取平均值。另收集因正畸减数拔除的健康牙牙髓6例(男3例，女3例；年龄16～30岁)，作为正常对照组。

收集的所有组织样本用100 mL/L甲醛液固定后，不同浓度梯度乙醇逐级脱水、常规石蜡包埋，并制作4 μm厚连续切片。本研究获得了安徽医科大学生物医学伦理委员会的伦理审查批准(批准号:2014013)。

1.2.2 常规组织学观察及根尖病损类型判定

分别取上诉各样本组织切片，脱蜡、脱水后常规HE染色，光学显微镜下观察，并按以下标准判断根尖病损的类型。①根尖肉芽肿：根尖部组织形成增生的肉芽组织团块，周围有纤维结缔组织包绕，其中以炎性细胞和成纤维细胞为主； ②根尖囊肿：以各种厚度的纤维囊腔为诊断特征，纤维囊腔被覆复层鳞状上皮(厚薄不一)，上皮钉突因炎症刺激发生不规则增生、伸长，并相互融合成网状，上皮表现为明显的细胞间水肿和以中性粒细胞为主的上皮内炎症细胞浸润；纤维组织囊壁内炎症明显，炎性浸润细胞主要为淋巴细胞、浆细胞，混杂有中性粒细胞以及泡沫吞噬细胞浸润[16]。

1.2.3 免疫组织化学染色观察

1.2.3.1免疫组织化学染色方法

分别取上述各样本组织切片，65 ℃下烤片2 h后常规二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水，蒸馏水5 min； 30 mL/L过氧化氢 37 ℃孵育10 min，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗5 min×3次；置于640 mL枸橼酸缓冲液(pH 6.0)中用微波炉高火煮沸8 min，停 3 min再高火4 min，自然冷却至常温后PBS冲洗 3 min ×3次；正常羊血清液37 ℃下封闭30 min，倾去勿洗；分别滴加一抗兔抗人CypA 抗体(稀释浓度：1 ∶400)、RANKL抗体(稀释浓度：1 ∶150)；4 ℃ 冰箱孵育过夜(用PBS缓冲液代替一抗作空白对照)；PBS冲洗5 min×3次，滴加通用型生物素标记二抗，37 ℃孵育30 min；PBS冲洗 5 min×3 次；滴加过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37 ℃孵育30 min；PBS冲洗5 min×3次，DAB(3，3＇- diaminobenzidine,二氨基联苯胺)反应染色；自来水充分冲洗后苏木素复染1 min，常规脱水、透明、干燥、封片。

1.2.3.2 免疫组织化学染色鉴定

免疫组织化学染色以胞核、胞质或胞膜上出现黄色或棕色颗粒为阳性，显微镜400倍下从每张切片中随机选取5个视野用显微摄像系统拍摄照片，并用Image- pro- plus 6.0图像分析系统分析每个组织切片上CypA和RANKL的蛋白平均吸光度值(A值)。

1.3 统计学分析

数据分析采用SPSS 17.0和EXCEL统计软件。首先用Image- Pro plus图像处理系统计量每个组织切片上CypA、RANKL的蛋白平均吸光度值(A)，并将数据录入Excel 2003软件，然后采用SPSS 17.0软件对数据进行分析：Kolmogorov-Smirnov检验显示CypA和RANKL在根尖肉芽肿和根尖囊肿中的表达呈现非正态分布，使用Mann-Whitney U test比较两者在不同病变类型(对照组、根尖囊肿和根尖肉芽肿)间的表达情况；各组RANKL和CypA的相关性分析采用直线相关，先绘制散点图，并求其相关系数r，之后再做显著性检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 组织样本基本情况及病理检测结果

83例根尖炎性组织样本有明显临床症状者39例、无明显临床症状者44例。

HE染色结果显示：83例根尖周炎组织样本中有49例为根尖肉芽肿，其组织中可见大量炎细胞浸润，包括大量的淋巴细胞和成纤维细胞，并可见成纤维细胞增殖形成的纤维组织 (图1a)；有34例为根尖囊肿，可见上皮组织不同程度的增生(图1b)。

a．根尖肉芽肿 b．根尖囊肿

图1 HE染色观察(×20)

2.2 免疫组化染色结果分析

2.2.1 实验组与对照组比较

83例根尖周炎组织中均检测出有CypA的表达，正常牙髓组织(阳性对照组)少见该因子表达，空白对照组中未检测出该因子表达。根尖周炎病变组织中CypA主要表达于炎细胞浸润区和上皮组织，主要阳性细胞为淋巴样细胞、上皮细胞、血管内皮细胞；正常对照组和空白对照组中少见CypA的表达(图2)。量化分析结果显示,实验组CypA的蛋白表达量和RANKL的蛋白表达量均明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。

2.2.2 肉芽肿组与囊肿组比较

免疫组化染色结果显示： CypA 在肉芽肿中的表达明显高于囊肿组(Z=4.48，P<0.05)；而RANKL在肉芽肿中的表达则明显低于囊肿组(Z=4.48，P<0.05)(图3～4)。

表1 各组样本中CypA和RANKL的表达情况比较

空白对照组 根尖周炎病变组织正常牙髓(阳性对照组)组织

图2 免疫组化染色观察(×40)

CypA在肉芽肿中的表达高于囊肿组(P<0.05) RANKL在肉芽肿中的表达低于囊肿组(P<0.05)

图3 CypA和RANKL在根尖囊肿、根尖肉芽肿中的表达比较

根尖肉芽肿 根尖囊肿

图4 根尖肉芽肿、根尖囊肿免疫组织化学染色结果(×40)

2.3 临床表现对比分析

免疫组化定量分析结果显示，有明显临床症状的根尖周炎组织中CypA和RANKL的A值分别为77.24(69.48～89.54)和85.07(78.57～91.15)，二者均明显高于无症状组的39.18(31.54～64.90)和48.09(38.36～74.35)，差异均有统计学意义(Z=2.724，P<0.05)(图5)。

2.4 CypA和RANKL与临床表现的相关性分析

CypA和RANKL的表达水平与根尖周炎的病变大小均呈正相关关系(P<0.05)(图6)；无论在有症状组中还是在无症状组中，CypA的表达量与RANKL的表达量均呈正相关关系(r=0.938,P<0.05;r=0.958,P<0.05)(图7)。

图5 CypA和RANKL在两组根尖病损中的

图6 CypA和RANKL蛋白的表达水平与根尖稀疏区大小的相关性

图7 两组中CypA与RANKL蛋白表达水平的相关性比较

3 讨论

本实验首次研究了CypA在人类慢性根尖周炎中的表达情况，并结合临床表现分析其在根尖周炎中可能发挥的作用。在心血管疾病[12]、类风湿性关节炎[10]以及癌症[11]等相关研究中均已有大量的研究探讨了该因子的作用，并证明CypA可能以促炎方式参与炎症疾病的发生发展。最近在牙周病的相关研究中也有两篇文献报道了CypA参与牙周病的发生发展[13-14]，而目前尚没有CypA在根尖周病中的相关研究报道。RANKL是TNF超级家族中的一员，已经被很多研究证明是一种参与骨质破坏的因子[17]。鉴于根尖稀疏区的大小可反映临床根尖骨质破坏的程度，因此本实验通过比较CypA与RANKL蛋白表达量与临床表现的关系，来讨论CypA在根尖周炎中可能的作用。

在牙周炎的相关研究中，Li等[13]最先在动物牙周病模型中检测到CypA的表达。定量和相关性分析显示：CypA在炎性牙龈组织中的表达量明显高于正常牙龈组织；且与牙槽骨的丧失、巨噬细胞和淋巴细胞的浸润呈正相关。随后该作者又在人牙周病组织中发现了类似情况[14]，说明CypA可能参与牙周病中炎症反应和牙槽骨的丧失。本实验中通过免疫组化的方法检测到根尖周炎病损组织中有CypA的表达，其表达水平明显高于正常牙髓组织；提示CypA可能也参与了根尖周炎症的发展。

本实验分别比较了CypA和RANKL在不同病损组织中的表达水平，结果显示：CypA在根尖肉芽肿组织中的表达量相对较多，而RANKL在根尖囊肿组织中的表达量相对较多,与Zhang等[18]的研究结果相吻合。CypA和RANKL在肉芽肿和囊肿中表达情况不同，可能与参与两者表达的细胞不同有关。RANKL主要由成骨细胞、基质细胞及活化的T细胞表达[19]；而CypA主要由内皮细胞、巨噬细胞、淋巴细胞及血管平滑肌细胞表达[7-8,20]。同时有研究表明，CypA可作为一种强劲的趋化因子趋化中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞及T细胞到炎性部位[21-22]；由于肉芽肿主要由大量新生成的微小血管并浸润大量炎性细胞及成纤维细胞；囊肿主要有明显的纤维囊壁；因此本实验中CypA在巨噬细胞、成簇的内皮细胞及淋巴样细胞上明显着色，而囊肿中主要集中于上皮细胞，固有层内炎性细胞表达则相对较少。

本实验中CypA和RANKL均与患牙根尖稀疏区大小呈正相关，CypA与RANKL两者比较也呈正相关关系，说明CypA可能也参与根尖骨质破坏的进程。根尖稀疏区大小主要反映根尖骨质破坏的情况，RANKL是已知的参与骨破坏的重要因子[17]。RANK- RANKL- OPG三者平衡体系一旦失衡(RANK/RANKL/OPG system)，即会发生相应的骨质破坏[23-24]。Yang等[10]对RA(Rheumatoid arthritis，类风湿性关节炎)进行研究时发现，在RA中，CypA- CD147相互作用可上调MMP- 9的表达量，并通过促进单核细胞/巨噬细胞粘附到细胞外基质上而导致软骨和骨的破坏。MMPs(Matrix metalloproteinase)为基质金属蛋白酶，在牙周组织胞外基质降解过程中有重要的作用[25]。与此同时，Wang等[22]也有类似的发现，并提出CypA可明显提高MMP- 2和MMP- 9的分泌、促进细胞入侵及单核细胞释放炎性细胞因子的量；此外，实验中还发现，注射CypA组的软骨吸收率明显高于对照组，说明其与破骨有关。目前已有研究指出，基质金属蛋白酶也参与牙槽骨的骨破坏[26]。除此之外，Li等[14]还发现，在炎性牙龈中CypA的表达量与MMP- 1/MMP- 2/MMP- 9表达量呈正相关；提示CypA可能参与牙周组织中的软、硬组织的破坏。因此，CypA可能作为一个新的切入点来重新考量软骨及骨降解的炎性过程。

当有炎症刺激时，CypA可以被细胞释放到胞外并与细胞膜上的EMMPRIN(Extracellular matrix metalloproteinase inducer,胞外基质金属蛋白酶诱导剂)结合，CypA可通过与EMMPRIN相互作用调节炎性反应，促进炎性细胞释放基质金属蛋白酶[10]。Liu等发现CypA和EMMPRIN同时位于浸润的巨噬细胞、淋巴细胞上，而在一些多核细胞上也有附着，说明CypA- EMMPRIN存在于牙周病炎症反应中；同时还发现，CypA在炎性牙龈组织中过度表达且分布广泛，并发现300 ng/mL的CypA与100 ng/mL及500 ng/mL相比对中性粒细胞的趋化作用最强，可使其在牙周组织中的浸润程度明显增加，并使TNF- α/IL- 8的分泌量增加[13-14]。Kim等[20]也发现，内皮细胞经LPS刺激后可分泌CypA，并能在体外实验中反作用调节内皮细胞的活性，且不同浓度的CypA对内皮细胞TLR- 4的表达有明显的影响，说明CypA与炎症相关。

总之，本实验通过免疫组化的方法检测了CypA在根尖周炎性组织中的表达情况，所得结果提示，CypA可能参与根尖周炎炎症的发生发展，并可能与破骨有关。该结果有助于进一步理解根尖周病的发病机制和病变的发展。但还需进一步的实验来详细阐明CypA在根尖周病中的作用。

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Immunolocalization of cyclophilin- A in human apical periodontitis lesions

WANG Yan- qing*, HU Ju- hua, LI Song, HU Shu- li, ZHANG Hong- yan

(*StomatologicHospital﹠College,AnhuiMedicalUniversity,KeyLab.ofOralDiseasesResearchofAnhuiProvince,Hefei230032,China)

AIM: To examine the expression of cyclophilin A (CypA) in human periapical lesions and to investigate its relationship with the clinical symptoms of periapical periodontitis. METHODS: Samples of human apical periodontitis lesions of 83 cases were subjected to immunohistochemical examination for CypA and RANKL expression. Six 6 healthy dental pulp samples obtained from orthodontic patients served as the controls. The integrated average optical density value (A) of CypA and RANKL was measured by immunohistochemical analysis for all the samples. Differences in CypA and RANKL expression between different clinical presentations were subsequently analyzed by t-test. RESULTS: CypA postitive cells and RANKL positive cells were both detected in all periapical lesion tissues, and the expression of CypA was significantly higher in periapical lesions than in normal tissues (P<0.05). Epithelial cells, lymphoid cells and endothelial- like cells showed CypA positive in the lesions. The expression of RANKL in cyst group were higher than in granuloma group (Z=4.48,P<0.05), while the expression of CypA in granuloma group were higher than in cyst group (Z=4.48,P<0.05). The average (A) value of CypA positive sites in periapical lesions with clinical symptoms was higher than that without clinical symptoms(77.24 versus 39.18,P<0.05). Positive correlation was observed between CypA expression and lesion size(r=0.462,P<0.05). Moreover, positive correlation between RANKL expression and lesion size was observed (r=0.417,P<0.05). CONCLUSION: CypA might be involved in the inflammatory response and bone resorption, and associated with periapical lesion pathogenesis.

cyclophilin- A; RANKL; periapical lesions; clinical presentations

2014-09-14

安徽省自然科学基金(070413141)

王艳青(1990-)，女，汉族，安徽芜湖人。硕士生(导师：张红艳)

张红艳, E-mail: toothyan@126.com

R780.2

A

1005-2593(2015)02-0073-07

安徽高校省级自然科学研究项目(KJ2011Z168)

安徽省高校教学质量与教学改革工程项目(20100352)