长庆油田石油污染土壤微生物种群多样性研究*

杨琴 张海玲 刘锐 聂麦茜

（1.中国石油长庆油田油气工艺研究院；2.低渗透油气田勘探开发国家工程实验室；3.西安建筑科技大学）

长庆油田石油污染土壤微生物种群多样性研究*

杨琴1，2张海玲1，2刘锐1，2聂麦茜3

（1.中国石油长庆油田油气工艺研究院；2.低渗透油气田勘探开发国家工程实验室；3.西安建筑科技大学）

以姬塬油田井场石油污染土壤为研究对象，通过高通量测序，分析了细菌群落的类型和结构，结果显示3份土壤样品中共检测到包括变形菌门、放线菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、酸杆菌门和疣微菌门等24个门的细菌，土壤微生物结构多样性丰富，揭示了原油污染土壤的微生物种群多样性情况，对石油污染微生物治理技术具有重要的意义。

石油污染；土壤；生物种群；高通量测序方法

0 引 言

在石油开采、加工和运输过程中，石油及其产品进入土壤引起土壤的污染和破坏［1］。石油污染土壤修复治理困难，已成为不可忽视的环境问题［2］。

20世纪60年代，人们开始接种微生物以加快和促进有机污染物的降解，现在生物修复技术已作为原油污染土壤修复的首选措施［3］。由于研究区域油田散布于黄土塬农业区中，微生物是土壤生态系统中的重要成员［4］，而石油污染土壤中的微生物是油泥生物可降解性的重要表征参数，因此石油污染土壤中的微生物种群结构与多样性是研究油泥微生物处理技术的理论基础与重要的技术依据。本文以高通量分析为技术手段，对于长庆姬塬油田石油污染和未污染土壤中的细菌微生物种群进行了比较分析，揭示了其中的种群结构差异和优势微生物种群，为认识石油污染对土壤微生物种群特性的影响提供了基础。

1 材料与方法

1.1 土样采集

选择长庆姬塬油田3个丛式井场，采用网格法在每个井场利用带有刻度的管型取土器采集9份油污土壤样品，充分混合成3份后封闭于密封袋中放置于-80℃的冰箱中储存，以备后续检测分析。

1.2 土壤细菌的16S rD N A基因测序

①土壤微生物基因组D N A提取及其16S rD N A基因的V3区片段扩增分析。

利用土壤D N A提取试剂盒（Fast D N A Spin Kit for Soil，M P Bio medicals，美国）提取16个土壤样本的D N A（具体D N A提取步骤参考试剂盒说明书）。针对16S rD N A V3区进行聚合酶链式反应（PC R）预试验，然后进行大批量P C R扩增（Herculase II Fusion D N A Poly merase，Agilent，600677B），使用的引物为：F 5′-C C T A C G G G A G G C A G C A G-3′，R5′-A T T A C C G C G G C T G C T G G-3’。P C R扩增程序如下：95℃预变性2 min；95℃变性30 s，48℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环；最后72℃终延伸5 min结束［5］。

②P C R产物纯化与定量。

通过P C R聚合酶链式反应获得不同土壤样品细菌的P C R产物后，进行琼脂糖凝胶电泳分析，针对目标条带进行割胶回收，获得纯化的P C R产物（QIA Quick Gel Extraction Kit，Qiagen，28704）。利用Qubit 2.0荧光定量仪器对其定量。

③D N A双末端修复与富集。

通过3′-5′核酸外切酶及聚合酶的共同作用，修复带有突出末端的D N A片段。在连接酶的作用下，孵育含有标签的接头与D N A片段，使其相连。利用P C R选择性地富集两端连有接头的D N A片段，同时扩增D N A文库。

④验证文库、均一化并混合文库、上机测序。

利用Qubit2.0荧光定量仪定量DNA（Quant-iT ds DNA HS Assay Kit，Q32851；Invitrogen），通过Agilent 2100对P C R富集片段进行电泳完成质量控制，验证DNA文库的片段大小及分布规律（Agilent 2100 Bioanalyzer，Agilent，2100；Agilent High Sensitivity D N A Kit，A gilent 5067-4626），多样品D N A文库（Multiplexed DNA libraries）均一化至10n mol/L后等体积混合，将混合好的文库（10 n mol/L）逐步稀释定量至26p mol/L后在Ion Torrent测序平台上测序。

1.3 数据处理

①原始数据处理与样本序列数目统计。

试验采用单端测序。首先对原始数据进行质量控制，截断或舍弃低质量序列（50个连续碱基平均质量＞25，序列长度＞50）。利用Flash软件将通过质量控制的序列对应的两端进行连接，舍弃无法连接的序列。根据试验要求，对连接上的序列进行过滤（连续相同碱基＜6；模糊碱基＜1），获得最终用于分析的序列。

②生物信息学分析。

应用Qiime（quantitative insights into microbialecology），根据序列的相似度，将序列归为多个OTU（operational taxonomic unit）。OTU产出后，统计各个样品含有O T U情况及每个OTU中含有序列的数目。通过寻找最近亲缘物种的方法，得到每个O T U的分类学信息。选取相似度在97%条件下的O T U生成预期的稀释曲线，并利用软件mothur计算丰富度指数Chaol和A C E，覆盖度指数（good’s coverage）以及多样性指数Simpson和Shannon指数进行Alpha多样性分析。利用Excel、P Co A、Correlation聚类法分别进行数据处理、细菌群落分布、主成分分析和聚类分析。

2 结果与分析

2.1 土壤样本测序结果及取样深度验证

本研究利用高通量测序方法，共读取4个土壤样品中微生物16S rD N A基因序列135 453条，其中66 535条长度大于200 bp的片段经比对属于细菌。图1为高通量测序序列长度分布情况，经过统计得知片段长度大于200 bp的序列占序列总数的72.32%。各样品序列测序量在28 738～38 700条之间，平均为33 863条［6］，对原始数据进行质量控制，截断或舍弃低质量序列后各样品有效读数14 056～18 628条，平均为16 634。应用Qiime，根据序列的相似度，将序列归为7 778个O T U。各样本测序获得的细菌O T U序列读数如表1所示。

图1 高通量测序序列长度分布

表1 土壤样本测序获得的细菌OTU读数

在不同遗传距离上绘制样品的稀释曲线，如图2所示。该曲线表明每个样品的取样深度，用来确定每个样本测序的数量是否达到饱和。从图2（a）、（b）中可以看出，当序列较少时，随着样本中测序数量的增加，O T U数目剧增。随着测序量的不断增大，O T U数目增加趋于平缓，但仍然未达到饱和，提示样本内仍有少量的新的微生物种类没有被发现。Shannon多样性指数能够预测并比较样本微生物种群的多样性。尽管随着测序量的增大，不断有新的物种出现，但Shannon指数达到饱和，曲线趋于平缓（图2（c）、（d））。说明本次试验4个样本的测序量基本能够反映土壤样本中细菌群落的多样性组成。

2.2 高通量测序分析土壤菌群结构

所有66 535条序列分属于细菌的24个门，其中主要的门包括Proteobacteria（变形菌门）、Actinobacteria（放线菌门）、Firmicutes（厚壁菌门）、Bacteroidetes（拟杆菌门）、Acidobacteria（酸杆菌门）、Verr-ucomicrobia（疣微菌门），说明土壤细菌类型丰富。

除去未确定种属的其他菌类和相对含量小于1%的菌类，三个来自油田土样和未污染的空白（黄土高原土样）之间细菌组成和土壤细菌相对丰度差异较大。对比土壤细菌群落的优势菌群发现，四种土壤样品细菌群落的优势菌群为：放线菌门+变形菌门（土塬30-103井）、变形菌门+放线菌门（#D4M）、变形菌门+拟杆菌门（沙19-19井）、变形菌门+放线菌门（空白）。土壤细菌相对丰度从大到小依次为：空白、土塬30-103、#D4M和沙19-19井。说明：长时间的石油污染对土壤菌群结构和土壤细菌相对丰度影响较大。

图2 土壤样本16S rDNA基因序列高通量测序的稀释曲线

2.3 土壤样品O T U分布Venn图分析

将土壤样品O T U分布进行Venn图分析，如图3所示。结果表明：四种土壤样品中均有分布的O T U为11个；两两相比共有O T U数目最多的是空白和土塬30-103（211），最少的为沙19-19井和土塬30-103（11）；三种石油污染土样中共有33个O T U；四种土壤样品中独有的O T U数从大到小依次为：土塬30-103（5 166）、#D4M（1 743）、空白（1 269）和沙19-19井（481）。说明：土壤在长期石油污染的选择压力下，土壤菌群结构发生明显改变，能利用石油为碳源的菌（即石油降解菌）逐渐成为优势菌群；不同的地理环境、土壤理化性质及石油污染强度、时间均可影响菌群变化进程，三种石油污染土样相比，土塬30-103土壤样品中独有的O T U数最多为5 166，从中分离到高效石油降解菌的可能性最大。

图3 土壤样品OTU分布Venn分析

2.4 土壤样品O T U分布H eatmap图分析

根据各样品中O T U的分布及丰度进行聚类后进行H eatmap图分析，如图4所示。结果表明：土壤样本间亲缘关系，#D4M、土塬30-103和空白较近、而沙19-19井和空白较远。这可能与样品所处的地理环境、土壤理化性质及石油污染强度、时间有关。

图4 土壤样品OTU分布的Heatmap分析

3 结 论

通过高通量测序方法分析了土样中土壤微生物的遗传多样性分析。共读取到135 453条16S rD N A基因序列，其中66 535条长度大于200 bp的片段经比对属于细菌。测序的覆盖度均大于80%，表明测序量基本能够反映该区域细菌群落的种类和结构。

3份土壤样品中共检测到包括变形菌门、放线菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、酸杆菌门和疣微菌门等24个门的细菌，土壤微生物结构多样性丰富。土壤在长期石油污染的选择压力，土壤菌群结构发生明显改变，能利用石油为碳源的菌（即石油降解菌）逐渐形成优势菌群，且优势菌群明显成为治理石油污染土壤的高效降解菌种的潜在微生物群体。

［1］ 马强，林爱军，马薇，等.土壤中总石油烃污染（T P H）的微生物降解与修复研究进展［J］.生态毒理学报，2008，3（1）：1-8.

［2］ 曹辉，郭晶，马魁堂，等.石油污染土壤治理研究进展［J］.现代农业科技，2011（23）：309-310.

［3］ 李美玉.石油污染土壤中石油烃微生物降解性能的研究［D］.青岛：中国石油大学（华东），2010.

［4］ 张清敏，刘曼，周湘婷.微生物肥料在土壤生态修复中的作用［J］.农业环境科学学报，2006（增刊）：283-284.

［5］ 李友发，宋兵，宋亚娜，等.福建省稻田土壤细菌群落的16S rD N A-PC R-D G G E分析［J］.微生物学通报，2008，35（11）：1715-1720.

［6］ 余悦.黄河三角洲原生演替中土壤微生物多样性及其与土壤理化性质关系［D］.济南：山东大学，2012.

10.3969/j.issn.1005-3158.2015.05.007

1005-3158（2015）05-0022-04

2015-01-12）

（编辑 王蕊）

国家自然科学基金面上项目（51278405）；陕西省国际科技合作重点项目（2012 K W-25）。

杨琴，2008年毕业于西安建筑科技大学环境科学专业，硕士，现在中国石油长庆油田油气工艺研究院从事油气田安全环保技术研究工作。通信地址：西安市未央区明光路长庆油田油气工艺研究院，710018