附着剑菌对三氯联苯的吸附及降解机制研究

陈 雄，韦祎旸，李辉信，梁明祥，徐 莉（南京农业大学资源与环境科学学院，江苏 南京 210095）

附着剑菌对三氯联苯的吸附及降解机制研究

陈 雄，韦祎旸，李辉信，梁明祥，徐 莉*（南京农业大学资源与环境科学学院，江苏 南京 210095）

实验研究附着剑菌（Ensifer adhaerens.R2）对持久性有机污染物三氯联苯（2，4，4´-TCB，PCB28）的去除机制，探究菌株对2，4，4´-TCB的生物吸附和生物降解作用，以及其随时间、pH值、温度、菌体密度、金属离子（Ca2+、Mg2+）的变化.灭活菌体对PCBs的去除机制为生物吸附，吸附率在2h基本达到平衡，为85.97%；活体菌株可以通过生物吸附及生物降解作用去除2，4，4´-TCB，在本次实验周期内主要以吸附作用为主，2h吸附率为60.59%，明显高于降解率的12.90%.单因素条件下，pH值为6.0、35℃、OD为0.8、添加1mol/L的Ca2+、Mg2+处理可使活菌对2，4，4´-TCB的吸附达到最优；pH值为7.5，30℃，添加0.05mol/L的Ca2+、Mg2+处理可使活菌对2，4，4´-TCB的降解达到最优.

附着剑菌；三氯联苯；生物吸附；生物降解

多氯联苯（PCBs）是存在于环境中的一类具有“三致”效应的持久性有机污染物，由于广泛存在，且威胁着人类健康，引起各国政府、学术界、工业界和公众的关注.

我国大部分水体的PCBs污染水平较低，然而也有部分地区的水环境中存在严重的PCBs污染，如珠江、大连湾、松花江等均有较高的PCBs污染存在［1］.常规净水工艺在应对水源中有机污染时，显得处理能力不足.生物修复以其环境破坏小、经济效益高、技术简便可行等优点，成为最具有潜力的污染修复方法之一［2］.

目前已有许多利用微生物去除有机污染的研究，许多高效PCBs修复菌株被发现，真菌如白腐真菌（ligninolytic fungi）；细菌如伯克霍尔德式菌（Burkholderia）、假单胞菌属（Pseudomonas）、红球菌属（Rhodococcus）［3-5］.在剑菌（或称中华根瘤菌）方面，Bae等［6］报道了根瘤菌有耐受并转化广谱芳香烃化合物的能力，并且根瘤菌可与植物联合修复PCBs污染土壤［7-9］，徐莉等［10］也发现苜蓿根瘤菌对低氯代多氯联苯及混合PCBs有较好的修复效果.但对于微生物去除PCBs的机制研究还不多［4］，有对海洋青霉真菌去除PCBs的机制研究，得到菌体可通过吸附作用、共代谢降解作用，实现对PCBs的去除，其中吸附作用是有效去除的主导因素［11］.而在微生物去除有机污染物机制中，除了吸附作用外，也有生物降解作用，有研究表明白腐真菌对多环芳烃的去除，在短期内主要为生物吸附作用，随着培养时间的延长，菌体的对多环芳烃的生物降解作用日益加强［12］.

基于本实验室获得的具有2，4，4′-TCB单体去除能力的附着剑菌（Ensifer adhaerens. R2）作为主体，探究其去除机制，为进一步研发PCBs污染水体的修复技术提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料与培养基

供试菌株:剑菌为本实验室所有，经鉴定为附着剑菌（Ensifer adhaerens），命名为R2，2h活菌和灭菌处理对20mg/L的2，4，4′-TCB去除率分别可达73.28%、91.47%.标准品2，4，4′-TCB购于北京百灵威化学技术有限公司.丙酮与正己烷为色谱纯，其他试剂均为分析纯.

甘露醇酵母汁琼脂培养基（YMA）组成:甘露醇10.0g，磷酸氢二钾（K2HPO4） 0.5g，硫酸镁（MgSO4·7H2O） 0.2g，氯化钠 （NaCl）0.1g，酵母汁（1%）100mL，蒸馏水900mL，固体培养基中加入15.0g/L琼脂粉.

磷酸缓冲液（PBS）母液组成:0.2mol/L磷酸氢二钠（Na2HPO4）:71.6g溶于蒸馏水定容至1L；0.2mol/L磷酸二氢钠（NaH2PO4）:31.2g溶于蒸馏水定容至1L.

表1 不同pH值的PBS的配制Table 1 Preparation of PBS of different pH

1.2 附着剑菌的发酵培养

将菌种接种于YMA固体平板上30℃活化48h，挑取单菌落接入3mL液体种子YMA试管培养基中扩大培养，然后以1%的接种量（M/V）再次转接到50mL YMA液体培养基中30℃、180r/min培养24h.

1.3 附着剑菌去除2，4，4′-TCB的机制研究

将发酵培养的菌悬液（此时OD为1.3）离心（12000r/min、5min），收集菌体，用pH7.0的0.05mol/L 磷酸缓冲液（PBS）洗涤两次后重悬，将菌体转接入含有20mg/L的2，4，4′-TCB的PBS中，调整菌体OD值为0.8，30℃、180r/min摇床培养，设置活菌和灭菌两组处理.测定计算转化0.1、1、2、4、8、18、24h后2，4，4′-TCB的去除率、吸附率、降解率.

1.4 不同条件影响下附着剑菌对PCBs的生物吸附和生物降解作用

菌体离心、洗涤、用PBS重悬后，转接入以20mg/L的2，4，4′-TCB的PBS中，180r/min转化2h，选取pH值、温度、OD值、金属离子浓度四因素进行实验（如表2），考察其对菌株R2去除、吸附、降解2，4，4′-TCB的影响.

表2 实验因素与水平Table 2 Factors and levels of design

1.5 2，4，4′-TCB的提取和测定

菌株与2，4，4′-TCB加入到缓冲体系后，在设定的采样时间，全部菌液离心（3500r/min，10min），分别收集上清和菌体，用2倍体积的正己烷萃取，涡旋5min，静置1h，吸取两者上层清液，过0.22μm的滤膜，置于棕色进样瓶待测.

采用带有电子俘获检测器和自动进样的Thermo AS3000型气相色谱仪分析.色谱柱:DB-1701（30m × 0.25mm × 0.25μm），进样温度为260℃，检测器温度为300℃.程序升温:初始温度为120℃，0.5min，10℃/min梯度升温至180℃，持续1min，然后15℃/min梯度升温至250℃，持续25min.无分流进样1µL，载气为高纯氮，流速1.0mL/min.

1.6 数据处理方法

活菌去除率（%）=［（空白样中PCBs含量-上清中PCBs含量）/空白样中PCBs含量］×100%

活菌吸附率（%）=［菌体中PCBs含量/空白样中PCBs含量］×100%

活菌降解率（%）=活菌去除率（%）-活菌吸附率（%）

灭菌去除率（%）=［（空白样中PCBs含量-上清中PCBs含量）/空白样中PCBs含量］×100%

灭菌吸附率（%）=［（空白样中PCBs含量-上清中PCBs含量）/空白样中PCBs含量］×100%

采用SPSS 20.0统计分析软件进行数据分析及差异显著性检验；采用Origin8.0进行绘图.

2 结果与分析

2.1 附着剑菌对2，4，4′-TCB的生物吸附和生物降解作用

由图1可见在24h内，灭菌处理中去除率和菌体吸附率一致，并在实验时间范围内保持稳定，说明生物吸附是灭活菌体去除溶液2，4，4′-TCB的唯一途径.活菌处理下生物吸附和生物降解作用同时存在，且菌株的吸附率高于降解率，说明菌体在短期内主要发挥的是吸附作用［13］.

灭菌处理的去除率明显高于活菌对照，这与Binupriya等［14］的研究结果相同，这主要可能是由于细胞经高温高压灭菌后，细胞壁破碎，使得更多的细胞表面官能团被暴露，出现更多的结合位点，显著提高了吸附性能［15-17］.

随着时间的延长，2，4，4′-TCB去除率、菌体吸附率、2，4，4′-TCB降解率均呈先快速上升后平稳的趋势，在添加2，4，4′-TCB 6min后，活菌和灭菌处理的去除率分别达46.89%和82.14%，2h基本达到平衡，此时活菌处理的去除率、吸附率、降解率分别达73.28%、60.59%，16.09%，灭菌处理的去除率为91.47%，菌体吸附在短时间（2h）即可达到较高的吸附率与叶锦韶等［18］报道的菌体对有机物三苯基锡吸附的研究结果相似.推测菌体的吸附作用与根瘤菌细胞壁上的脂多糖（LPS）及一些胞外产物中的荚膜多糖（CPS），蛋白质和糖醛酸等聚复合体有关，这些物质表面存在丰富的官能团（羧基、氨基、羟基、磷酸基等），为PCBs提供了结合位点，使其易于吸附水体中的PCBs［17，19-22］.

图1 附着剑菌R2对2，4，4′-TCB的生物吸附和生物降解随时间的变化Fig.1 Effect of time on the contributions of biosorption and biodegradation in removal of 2，4，4′-TCB by E. adhaerens

2.2 pH值影响下附着剑菌R2对2，4，4′-TCB的生物吸附和生物降解作用

由图2可见，不同pH值条件下R2活菌的吸附率总体高于降解率.其中吸附率随pH值升高呈先下降后逐渐平稳的趋势，6.0为最优pH值，此时吸附率为56.17%.这可能是由于pH值是影响生物吸附的重要因素之一，通常，它可以通过影响吸附剂及有机物的溶解性、电荷状况，对结合点位及静电作用为主要机制的吸附过程的影响尤为明显，pH 值对吸附的影响主要通过改变吸附质与吸附剂表面电性，进而影响二者间的静电作用来实现的［23］，因为2，4，4′-TCB的分子结构与性质不会随pH值变化而明显变化，所以可能是pH6.0的环境更易于菌体表面的酸性多糖发挥活性从而促进吸附.Fu等［24］利用黑曲霉吸附刚果红的实验也出现了相同的结果，即在pH6.0时展现了最好的吸附效率.降解率随pH值升高呈上升趋势，最高可达19.45%，可能是中性环境更易于菌体的生长和相关的降解酶发挥活性的缘故.

图2 pH值对附着剑菌R2对2，4，4′-TCB的生物吸附和生物降解的影响Fig.2 Effect of pH on the contributions of biosorption and biodegradation in removal of 2，4，4′-TCB by E. adhaerens

2.3 温度影响下附着剑菌对2，4，4′-TCB的生物吸附和生物降解作用

图3 温度对附着剑菌对2，4，4′-TCB的生物吸附和生物降解的影响Fig.3 Effect of temperature on the contributions of biosorption and biodegradation in removal of 2，4，4′-TCB by E. adhaerens

由图3可见，随着温度的升高，去除率呈先上升后略微降低的趋势，最高可达69.06%，吸附率同样明显高于降解率.吸附率随温度升高呈上升趋势，最高分别可达57.34%.这可能因为在此温度范围内菌体的吸附为吸热过程，温度升高更利于吸附反应的进行［16］.降解率随温度升高呈下降趋势，可能是因为微生物对污染物的降解是一种酶促降解过程，温度的变化直接影响降解酶的活性，高温对酶活有一定的抑制作用.

2.4 OD值影响下附着剑菌对2，4，4′-TCB的生物吸附和生物降解作用

图4 OD对附着剑菌对2，4，4′-TCB的生物吸附和生物降解的影响Fig.4 Effect of OD on the contributions of biosorption and biodegradation in removal of 2，4，4′-TCB by E. adhaerens

由图4可见，随着菌体的增加，2，4，4′-TCB去除率呈上升而后逐渐平稳的趋势，活菌的吸附率高于降解率；吸附率及去除率均随OD值增加呈先升高后平稳的趋势，最高分别达56.99%、70.77%；说明一方面，菌量影响污染物的去除和吸附，这与Sreekumar等［25］的结论是一致的；但吸附作用是有限的，达到一定程度，吸附效率将不再提高，可能是由于吸附剂的浓度达到某一特定值后，菌体开始出现堆积，反而导致可用于吸附的净表面积减少，所以吸附效率没有上升，程林洁［26］关于木霉吸附废水中的铬的实验中也出现了类似的现象，实验所用附着剑菌能够产生丰富的多糖，多糖易使菌集结成团，影响了菌体有效吸附的面积，所以生物吸附效率在0.2～0.8OD没有明显变化.降解率随OD值增加没有明显变化，稳定在20%左右，PCBs的降解是酶促降解过程，菌体对污染物有一个适应过程和酶活的诱导激活过程，而本实验所设置的2h的时间周期可能相对来说较短，所以就是增加菌体密度，降解率也没有显著升高.

2.5 金属离子影响下附着剑菌对2，4，4′-TCB的生物吸附和生物降解作用

从图5可以看出，添加2种金属离子处理后，菌体的去除率呈上升趋势，菌体的吸附率依旧高于降解率，吸附率均随离子浓度的升高呈升高的趋势，Mg2+的处理效率高于Ca2+，Mg2+处理后吸附效率最高可达79.39%，Ca2+处理后吸附效率最高可达73.00%，这与漆叶琼等的研究结果相似［27］，而降解率均随离子浓度升高呈降低趋势.可能是由于降解是酶促反应过程，有报道认为菌体的相关降解酶（如漆酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、联苯双加氧酶等）的活性会受到Ca2+、Mg2+的调节，低浓度Ca2+、Mg2+会促进酶活性［28］，而在高浓度情况下受到抑制，本实验条件设置的浓度可能相对较高，因此出现了抑制现象.关于钙镁对吸附的影响，有报道认为Ca2+、Mg2+处理后，菌体多糖的产量会得到提高，从而暴露更对的吸附位点，提高菌体的吸附能力［29］.

图5 不同浓度Mg2+、Ca2+对附着剑菌吸附2，4，4′-TCB和生物降解的影响Fig.5 Effect of metal ion on the contributions of biosorption and biodegradation in removal of 2，4，4′-TCB by E. adhaerens

3 结论

3.1 附着剑菌活菌对溶液中PCBs的去除包括生物吸附和生物降解作用，实验周期内生物吸附所占比列更大；剑菌的灭活处理对PCBs的去除机制为生物吸附，且吸附效率高于活菌处理.

3.2 附着剑菌对PCBs的去除在较短的时间内即可达到平衡，pH值、温度、OD值、金属离子处理均能不同程度地影响菌体对PCBs的吸附以及降解作用.活菌对PCBs的吸附效率随pH升高呈现先降低后平稳的趋势；随温度及Ca2+、Mg2+浓度升高呈增大的趋势，且Mg2+处理效率更高；随OD值增加呈先升高后平稳的趋势.活菌对PCBs的降解率随pH值呈先升高后平稳的趋势；随温度升高逐渐减小；随Ca2+、Mg2+浓度升高呈降低的趋势；降解率随菌体密度增加无明显变化.

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Biosorption and biodegradation mechanisms of trichlorobiphenyl by Ensifer adhaerens.

CHEN Xiong， WEI Yi-yang，LI Hui-xin， LIANG Ming-xiang， XU Li*（College of Resources and Environmental Science， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）. China Environmental Science， 2015，25（5）：1423～1428

This study was aimed to investigate the bio-dissipation mechanisms of 2，4，4´-trichlorobiphenyl （2，4，4´-TCB，PCB28） by Ensifer adhaerens， and explore the variation of the biosorption and biodegradation with the changes of time，pH， temperature， optical density， metal ions （Ca2+、Mg2+）. The removal mechanism of 2，4，4´-TCB by dead E. adhaerens was biosorption， the adsorption efficiency reached a plateau after 2h incubation，which was 85.97%. Both biosorption and biodegradation contributed to the removal of 2，4，4´-TCB by live E. adhaerens in water， and in this experimental period biosorption was dominated. The adsorption efficiency and degradation efficiency were 60.59% and 12.90% respectively. The highest adsorption efficiency of live strain was occurring at pH of 6.0， temperature of 35℃， OD of 0.8， cell pretreated with 1mol/L metal ion. The optimal degradation efficient of live strain was under the condition of 7.5pH， 30℃， biomass pretreated with 0.05mol/L metal ion.

Ensifer adhaerens；2，4，4´-trichlorobiphenyl；biosorption；biodegradation

X52，X172

A

1000-6923（2015）05-1423-06

陈 雄（1989-），女，江苏高邮人，硕士研究生，主要从事土壤生态及生态修复技术研究.

2014-09-19

江苏省自然基金（BK2011655）；中国科学院土壤环境与污染修复重点实验室（南京土壤研究所）开放基金；江苏省优势学科项目

* 责任作者， 副教授， xuli602@njau.edu.cn