仔猪源大肠杆菌耐药性分析

常晓敬

(卢龙县职业技术教育中心，河北秦皇岛066400)

为了解河北省仔猪源大肠杆菌耐药现状及耐药质粒的分布情况，本试验运用K-B 法对分离自河北省十个不同市县的已经过系统鉴定和致病性检验的40 株仔猪源大肠杆菌进行了22种常见抗菌药的药敏试验，并提取质粒，进行质粒谱型分析，初步探讨大肠杆菌耐药性与质粒图谱之间的关系。结果显示:40 株菌均为多重耐药菌株，6 耐和7 耐的居多，占了总数的42.5%，其中对氨苄西林、阿莫西林、四环素、复方新诺明耐药率较高，分别达到了95%，87.5%，85%和72.5%；对卡那霉素、庆大霉素、氯霉素和强力霉素耐药率也达到了40%以上。

1 绪论

由肠毒素性大肠杆菌引起的仔猪腹泻在我国及世界各地均有发生，每年死亡的仔猪中约有50%与此有关。随着养猪业向规模化发展，饲养密度不断增加，仔猪大肠杆菌性腹泻有明显上升的趋势，我国大多数省、市、自治区均有不同程度的发生与流行，该病已成为养猪业一个有重要经济意义的疾病。目前，对于仔猪大肠杆菌性腹泻病的防治主要是以注射疫苗以及应用抗菌药物为主要手段，但随着抗菌药物长期大量广泛应用，大肠杆菌耐药株不断出现，耐药谱不断扩大，使得大肠杆菌病成了疫病防制中的一大难题，严重困扰着养殖业的健康发展。为控制大肠杆菌耐药性的蔓延，加强对沙门氏菌耐药性的监测力度和大肠杆菌耐药机制的研究迫在眉睫。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 试验菌株

来自河北省邯郸市、秦皇岛昌黎县、秦皇岛抚宁县、张家口市等几个不同市县的已经过系统鉴定和致病性检验的猪源大肠杆菌20 株。

2.1.2 标准质控菌株

大肠杆菌ATCC25922 由本校预防兽医学实验室保存。

2.1.3 培养基及药品试剂

Mue11er-Hinton（MH）培养基、LB 肉汤、入DNA/HindⅢ、琼脂糖、TAE、凝胶载样缓冲液、22种药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司；相关试剂配置均按常规方法配置。

2.1.4 仪器

TGL-16 型高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂；凝胶成像分析系统（BIO－BEST200E），美国西盟生产；净化工作台（SW-CJ-ZFD 双人单面），苏净集团安泰公司；恒温培养振荡器（ZHWY-103B），上海智城分析仪器制造有限公司等。

2.2 抗生素敏感性试验

采用NCCLS 推荐的琼脂扩散法（K-B）测定已经生化鉴定和致病性检验的40 株猪源大肠杆菌对22 种常用抗菌类药物的敏感性。从培养了16～24 小时的麦康凯琼脂平板上，挑出单个菌落，直接用生理盐水制成0.5 麦氏单位。在15 分钟内，用无菌棉拭子蘸取调好的菌液，在MH 琼脂培养基表面涂布接种，将确定好的药敏纸片分贴到平板表面。纸片一旦与平板接触，不应再移动。37℃培养18～20 小时以后，测量各药敏纸片抑菌圈直径，同时以大肠杆菌ATCC25922 进行质控。参照NCCLS（2009）公布的标准以敏感、中介、耐药三种形式对抑菌圈作出判定，个别NCCLS（2009）没有列出但我国人医或兽医仍使用的药物按杭州天和微生物试剂有限公司提供的标准解释，见表1。

表1 药敏试验的判定标准

3 结果与分析

3.1 药敏试验结果

20 株致病性大肠杆菌对7 种临床常用药物的药敏试验结果见表2。20 菌株中对氨苄西林、阿莫西林、复方新诺明耐药率较高，分别达到了95%，87.5%和72.5%；对头孢菌素类药物的耐药率低于10%。

表2 20 株猪源大肠杆菌的耐药情况

3.2 大肠杆菌的耐药谱及多重耐药情况

20 株猪源大肠杆菌对7 种药物的耐药谱及多重耐药性情况可看出：20 株猪源大肠杆菌分离株共有26 种耐药谱，耐药谱完全相同的分离株最多4 株，大多数分离株都具有不同的耐药谱。

可知20 株大肠杆菌分离株均为多重耐药菌株，平均每株菌耐药5～6 种，最少为2 种，最多为10 种，6 耐和7 耐的居多，占了总数的42.5%，这与一些抗菌药物在生产中的长期使用有关。

4 讨论与小结

本试验中，临床分离的20 株仔猪源大肠杆菌均为耐药菌，共有26 种耐药谱。这些耐药菌株中，无单耐菌株。6 耐和7 耐的居多，占了总数的42.5%，耐药性产生严重的抗生素是磺胺类药物、四环素类、青霉素类药物，耐药率达到了70%以上，说明仔猪源大肠杆菌的耐药性以多重耐药为主，且耐药现象非常严重和普遍。这与养猪场在猪病预防治疗上使用以上抗生素，并在饲料中长期添加四环素类、阿莫西林等青霉素类抗生素有着密切的联系。张铁等（2005）从河北、北京、天津地区发生仔猪黄、白痢的十个猪场分离60 株大肠杆菌，对其耐药性进行了监测与分析。结果发现：耐药率较高的分别为链霉素(80%)、庆大霉素(53.3%)、氨苄青霉素(75%)、复方新诺明(86.7%)、痢菌净(76.7%)、呋喃唑酮(71.2%)、诺氟沙星、环丙沙星(51.7%)、喹乙醇(75%)和洛美杀星(70%)氟苯尼考(55%).60 株大肠杆菌多数为6 耐以上的菌株(80%),其中8 耐、10 耐、6 耐最高分别为17%、15%、12%。邢艳苹等（2010）对吉林分离出的113 株动物源性大肠杆菌耐药性进行分析，结果表明：113 株均表现出不同程度的耐药，耐药谱广，且多表现为多重耐药。大肠杆菌具有广泛的耐药性，推测这种现象的原因可能是：①我国养殖业抗菌药物使用不规范，存在盲目性，正常大肠杆菌对环境适应性增强，易产生耐药性。②耐药质粒在细菌间的水平传播也是细菌产生耐药性的一个重要原因。耐药质粒可编码细菌对药物的耐药性，耐药质粒可以在不同的细菌之间传递，通过耐药质粒的传递，耐药基因也就完成细菌间的广泛传播。