EGFR、Kras、BRAF在食管鳞癌组织中的表达及相关性

贺春语 胡晓娜 王雯 刘如 刘劲松 吴小源 王建华

(1.郑州大学附属肿瘤医院 放疗中心 河南 郑州 450008;2.河南省中医学院三附院 医学影像科 河南 郑州 450008)

表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor，EGFR)在众多实体瘤中过高表达，与肿瘤的发生、发展密切相关［1］。EGFR 的过度激活通过下游多条信号传导通路，可促进肿瘤细胞的转化、分裂、增殖，其中最重要的是Ras/Raf/MEK/ERK/MARP 信号通路［2］。鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1(v－ Raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1，BRAF)是一种癌基因，位于MARP 通道入口处，受上游Ras 蛋白激酶的调控［3］。一般情况下，当原癌基因转变为癌基主要通过高表达或表达功能异常的蛋白参与细胞的恶性转化。本文采用免疫组化SP 法对食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)组织中EGFR、Kras、BRAF 蛋白进行检测，探讨其临床意义。

1 资料和方法

1.1 一般资料 收集河南省肿瘤医院2007年1月至2009年8月临床资料完整的ESCC 病例116例及其石蜡包埋组织(手术标本100例、胃镜活检病理组织16例)，其中男74例，女42例;年龄32～76 岁，中位年龄58 岁;高、中、低分化分别为28、50、38例。采用2009年AJCC 食管癌TNM 分期标准分期，T1、T2、T3、T4期分别为26、30、46、14例，N0、N1、N2、N3期分别为52、34、21、9例，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分别为12、42、48、14例。选20例癌旁正常组织做对照。所有患者未接受过胸部放疗、化疗及其他抗肿瘤治疗。

1.2 方法 116例石蜡包埋的存档组织块，每例重新制备厚4 μm 连续切片，贴在涂有防脱胶的载玻片上脱蜡，然后用SP 法进行EGFR、Kras 及BRAF 免疫组化标记，免疫组化标记严格按照SP 试剂盒说明书的步骤进行。

1.3 结果判定 EGFR、Kras 及BRAF 均以细胞浆/胞膜内出现棕黄色细颗粒为阳性细胞。免疫组织化学染色以细胞质内出现特异性染色深浅来进行评分:0 分为无色，1 分为淡黄色，2 分为棕黄色，3 分为棕褐色;再依据染色细胞所占百分比评分:阳性细胞数＜10%为0 分，10%～25%为1 分，26%～50%为2 分，51%～75%为3 分，76%～100%为4 分。两项乘积即为该例免疫组织化学得分:(－)0 分;(+)1～2 分;(+ +)3～4 分;(+ + +)5～6 分。其中，(+ )和(+ +)定为弱阳性，(+ + + )定为强阳性。

1.4 统计学方法 应用SPSS 17.0 统计软件包进行统计分析，不同临床病理特征间同一指标比较采用t检验或χ2检验，各指标相关性采用Spearman 等级相关分析;检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 EGFR、Kras、BRAF 在ESCC 中表达 116例患者的ESCC 组织和20例癌旁正常组织中均检测出3 种蛋白的阳性表达，EGFR、Kras、BRAF 阳性表达率在ESCC 中表达分别为70.7%、31.0%和49.1%，均高于癌旁正常组织，其中EGFR、BRAF 在两者中表达差异有统计学意义(P ＜0.05)，而Kras 表达差异无统计学意义(P ＞0.05)，见表1。

2.2 EGFR、Kras、BRAF 的表达与ESCC 临床病理特征的关系 EGFR、Kras、BRAF 在ESCC 中的表达与性别、年龄无关(P ＞0.05)，EGFR 表达与分化、淋巴结转移、TNM 分期有关(P ＜0.05)，而与浸润深度无关(P ＞0.05)。BRAF 表达与浸润深度及分期有关(P ＜0.05)，与分化程度及淋巴结转移无关(P ＞0.05)。而Kras 在ESCC 中表达与分化、浸润深度、淋巴结转移及分期无关(P ＞0.05)。见表2。

表1 EGFR、Kras、BRAF 在ESCC 及其癌旁正常组织中的表达

表2 EGFR、Kras、BRAF 在ESCC 中的表达及与临床病理特征的关系

2.3 ESCC 组织中EGFR 与Kras、BRAF 蛋白表达的相关性分析 EGFR 与Kras 在ESCC 中均阳性表达25例，无明显相关性。而EGFR 与BRAF 表达呈正相关，相关系数r=0.542，P ＜0.05，见表3。

表3 EGFR 与Kras、BRAF 表达的相关性

3 讨论

我国是食管癌高发国家，其年发病患者数占世界总发病患者数的60%，虽然随着新型化疗药物的出现和治疗手段的改进，疗效已有明显提高，但5年生存率仍不足20%［4］。分子靶向药物为肿瘤治疗提供了新途径，以EGFR 为靶点的研究最为广泛。EGFR 属I 型跨膜酪氨酸激酶生长因子受体，在正常的生理状态下，EGFR 是细胞生长调节因子，介导细胞生长、增殖、分化等生命现象。EGFR 过表达后，与相应配体结合可激活细胞核内转导因子，加速细胞的恶性转化。研究显示30%～90%的食管癌患者存在EGFR 过表达，正常食管上皮基底细胞和间质细胞仅见低表达。常佳等［5］报道87例食管鳞癌中EGFR 阳性表达率明显高于癌旁组织，与组织学分级、浸润深度、淋巴结转移和TNM 分期有关。本研究显示116例食管癌组织中EGFR 的表达率为70.7%(82/116)，癌旁正常组织表达率为35% (7/20)，两者差异有统计学意义(P ＜0.05)，表明EGFR 的高表达与食管癌发生密切相关。随着食管癌分化程度、淋巴结转移及TNM 分期的增加，EGFR 蛋白表达的阳性率也随之增加，提示EGFR有促进食管癌生长与转移的作用。

Kras 基因编码21kDa 鸟苷酸结合蛋白，有3 种密切相关的Ras 蛋白，即Kras、Hras、Nras 构成小分子GTP 酶的Ras 超家族成员，它们可作为分子开关，传递细胞外信号，从而引发一系列基本的细胞过程，包括增殖、存活和分化。当前Ras 蛋白的生化模型提示，Ras以GDP 结合的非活化形式存在，当与GTP 结合则被启动，Kras 的启动将进一步激活Ras－Raf－MEK－ERK这条信号通路，导致细胞的异常增生，促使肿瘤形成。Kras 的突变已被证实与多种肿瘤密切相关［6］。本研究发现kras 的阳性表达率在食管癌组织中虽高于癌旁组织，但差异无统计学意义(P ＞0.05)。Kras 表达与临床分期、分化程度、浸润深度、淋巴结转移无关(P 均＞0.05)，其在食管癌发生发展中的作用有待进一步研究。

BRAF 是Ras－Raf－MEK－ERK 信号转导通路重要的转导因子，它主要通过丝裂原活化蛋白激酶通路中的丝/苏氨酸蛋白激酶发挥作用，此酶将细胞表面受体和Ras 蛋白通过MEK 和ERK 与核内的转录因子相连接，启动多种因子参与调控细胞内多种生物学事件，如细胞生长、分化以及凋亡等。生长调节因子介导细胞生长、增殖、分化等生命现象［7］。EGFR 与相应配体结合后，可激活细胞核内转导因子，促进细胞增殖，加速细胞的恶性转化。本研究食管癌组织中BRAF 的表达远高于癌旁正常组织(P ＜0.05)，随食管浸润深度程度和TNM 分期的增加而升高，提示BRAF 过表达可能促进食管癌的发生发展。

EGFR 靶向药物在食管癌治疗中取得重要进展，但报道并不一致［8－9］。本研究发现，食管鳞癌组织中EGFR 与BRAF 蛋白表达呈正相关，与Kras表达无关，提示我们需进一步深入研究，阐明EGFR靶向药物作用机制，联合检测EGFR 及BRAF 蛋白有助于食管癌的早期诊断，可对有效治疗方案的选择提供新的依据。

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