基于磁场诱导纳米金聚集的表面增强拉曼散射传感器用于细菌DNA的检测

马群　李艳乐　龚年春　江西　宦双燕

摘 要 以5，5′-二巯基-双（2-硝基苯甲酸）（ NB）为拉曼标记分子，利用磁珠的分选富集作用以及完全互补的两条DNA链间的杂交作用力，构建了一种基于表面增强拉曼技术检测细菌DNA的超灵敏方法。链霉亲和素包裹的磁珠通过生物素-亲和素连接上捕获探针，与目标细菌DNA序列部分互补杂交，目标链的另一端与拉曼染料和纳米金功能化的报告探针DNA链互补杂交。此设计利用磁球的聚集作用诱使颗粒间距离缩短，产生了等离子体共振耦合效应，从而使得检测的SERS信号显著增强。结果表明，在优化条件下，DNA浓度在5 pmol/L～5 nmol/L范围内，拉曼强度与DNA浓度的对数呈现较好的线性关系，检出限约为5 pmol/L。该方法设计简单，花费低廉，能用于细菌DNA灵敏且有选择性的检测。

关键词 表面增强拉曼； 纳米金； 5，5′-二巯基-双（2-硝基苯甲酸）； 细菌DNA； 磁聚集

1 引 言

表面增强拉曼散射（Surface-enhanced raman scattering， SERS）作为一种振动光谱，不仅能够提供分子内结构信息，具有指纹识别特征；并且SERS借助贵金属纳米结构的局域电磁场增强[1，2]，其增强因子可高达1014～1015[3，4]。此外SERS光谱与其它光谱相比具有稳定、不易猝灭、可用红光激发、对生物样品损坏小、不受生物样品自身荧光及水的干扰等特点，已广泛用于蛋白质[5，6]、DNA[7，8]、组织细胞[9]、小分子[10]、有机物[11，12]等的检测。

在20世纪80年代初期磁分离技术就已被提出[13]，磁性纳米颗粒因具有良好的磁响应性，高的分离效率和表面负载效率，较好的生物相容性和易生物降解等特点，可结合抗体、酶、细胞、DNA等功能分子，在生物分离、靶向给药、免疫测定和酶及细胞的固定等方面具有广泛的应用前景[14～18]。Jin等[19]合成了Fe2O3@AuNP的核壳结构的磁性纳米材料，并基于电化学方法检测大肠杆菌的DNA，从而进一步检测水样中的大肠杆菌；Choo等[20]利用磁球适配体传感器发展了一种高灵敏度检测凝血酶的SERS方法。

本实验以拉曼染料功能化的纳米金为识别元件，构建了一种新型磁珠分选富集和特异性捕获的SERS传感器，用于细菌DNA的检测。拉曼染料和DNA序列双修饰在纳米金上作为报告探针，通过目标细菌DNA互补杂交被捕获到磁珠上，通过磁珠的分离和富集，检测其SERS信号。这种方法不是将体系固定在二维的平面基底上，而是以磁珠为支撑材料，大大提高了捕获DNA的负载量，同时简化了分离、富集和洗脱程序。此外，通过磁场诱使纳米金聚集，产生等离子体耦合效应，在很大程度上提高了检测的灵敏度。因此，本方法能简便、快速地用于细菌DNA的分析检测，且具有较高的灵敏度和选择性。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

拉曼检测采用激光共聚焦倒置显微拉曼光谱仪（英国Renishaw公司）。激发波长为633 nm，激光功率为10 mW，镜头为100倍长焦，光谱采集间隔时间为10 s，积累次数1次。

链霉亲和素包裹的磁珠（SA-MB， 200 nm，河南惠尔科技有限公司）；5，5′-二巯基-双（2-硝基苯甲酸）（5，5′-Dithio-bis（2-nitrobenzoic acid）， NB）、4-对硝基苯硫酚（4-Nitrothiophenol， NTP）、4-对巯基苯甲酸（4-Mercaptobenzoic， MBA）、4-对巯基苯硼酸（4-Sulfanylphenylboronic acid， MPBA），购于Sigma-Aldrich公司；氯金酸（HAuCl4· 2O）、柠檬酸钠等其它试剂均为分析纯（上海国药试剂有限公司），无需进一步处理或纯化直接使用。实验用水经Millipore系统纯化（电阻系数>18.2 MΩ·cm）。实验室所用缓冲溶液和超纯水均需灭菌处理。实验所用核酸链均由TaKaRa生物技术（大连）合成，序列见表1。

2.2 金纳米颗粒的制备[21]

根据经典的柠檬酸钠还原法制备实验所用粒径为13 nm的金纳米颗粒（Au nanoparticles， AuNPs），步骤如下：将150 mL 0.01%氯金酸（HAuCl4· 2O）溶液边搅拌边加热到沸腾，然后迅速加入4.5 mL 1%柠檬酸钠溶液。溶液颜色由浅黄色逐渐变成酒红色后，继续加热沸腾 15 min。撤去热源，慢慢冷却至室温，将制备好的金纳米颗粒溶液置于4℃保存。

2.3 拉曼染料和报告DNA功能化的金纳米颗粒的制备[22，23]

参照文献，首先，取1 mL金纳米颗粒溶液以12000 r/min离心10 min，去除上层溶液，将底部沉淀重新分散在500 μL灭菌水中，然后，加入5 μL 1 mmol/L 拉曼染料溶液。室温放置30 min后，加入20 μL 100 μmol/L SH-DNA溶液，混合均匀，室温放置10 min。然后，每隔5 min加入1 μL Citrate-HCl 缓冲液（500 mmol/L，pH 3），使其终浓度为10 mmol/L。再加入HEPES 缓冲液（500 mmol/L， pH 7.6），将溶液的pH值调回中性，其用量为Citrate-HCl 缓冲液加入量的3倍，室温培养30 min。所得溶液于12000 r/min下离心10 min，并用5 mmol/L HEPES 缓冲液（pH 7.6）清洗两次，以充分除去未结合的拉曼染料和DNA。最后，悬浮在500 μL HEPES 缓冲液（5 mmol/L， pH 7.6），4℃储存备用。

2.4 捕获探针的固定

磁珠使用前， 先洗去其表面的防腐剂。然后加入略过量的生物素修饰的DNA溶液，室温下放置，时而轻敲离心管混合，孵育10 min，磁珠此时被覆了生物素化的DNA片段，用磁力架分离磁珠，操作如上，用缓冲液清洗2～3次。endprint

2.5 传感器的制备过程

8 μL固定了捕获探针的磁珠加入到100 μL结合缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，pH 8.0），再加入不同浓度的细菌DNA探针，混合液在45℃温育2 min，冷却至室温，磁力架分离，吸弃上清液后，再悬浮在100 μL结合缓冲液中，最后加入8 μL拉曼染料和报告DNA功能化的纳米金溶液，37℃下孵育30 min，冷却到室温，用结合缓冲液清洗2～3次，并悬浮在10 μL结合缓冲液中，备用。

2.6 拉曼检测

取上述制备好的溶液置于干燥洁净的玻璃片上，用磁力架聚集，吸弃上清液，稍干后置于拉曼仪检测。

3 结果与讨论

3.1 实验设计

本实验中构建的SERS传感器的原理如图1所示，在链霉亲和素包裹的磁性微球（SA-MB）上，通过亲和素-生物素之间强的非共价作用力，将一端修饰生物素的捕获探针（Bio-DNA）固定在磁性微球表面，捕获DNA链的碱基与细菌DNA的部分碱基互补杂交，余下的碱基将与拉曼染料和纳米金功能化的报告DNA探针互补杂交，通过磁珠的分离富集诱导纳米金聚集，产生显著的SERS增强信号。当细菌DNA不存在时，则无法在磁性微球上组装纳米金功能化的报告探针，从而无法产生显著的SERS增强信号。

图2 细菌DNA浓度为50 nmol/L时检测的SERS光谱图，不加细菌DNA（a）和加细菌DNA（b）

Fig.2 SERS spectra of bacterial DNA（50 nmol/L） detection， without the bacterial DNA （a） and with bacterial DNA （b）

3.2 DNA检测的现象验证

为了最小化荧光背景和提高信噪比，选择非荧光型的染料分子5，5′-二双（2-硝基苯甲酸）作为拉曼信标。图2是此传感器用于细菌DNA检测所得到的SERS光谱。对于空白组，光谱呈现非常弱的SERS信号，拉曼位移在1333 cm

处的特征峰的峰强为1.53×103 counts/cm（图2a），说明不存在细菌DNA链时，报告探针无法组装在磁珠的表面；对于实验组，光谱则呈现显著增强的SERS信号，拉曼位移在1333 cm

处的特征峰的峰强2.68×103 counts/cm （图2b），具有比较理想的信噪比17.6。

3.3 报告探针的表征

贵金属纳米颗粒具有较强的局域表面等离子体共振效应，在紫外可见波段有很强的吸收，图3A是采用柠檬酸三钠还原法制备的纳米金颗粒，测得其溶液的UV-Vis最大吸收波长为519 nm，可以推测其粒径约为13 nm[24]。纳米金颗粒表面同时修饰巯基DNA和拉曼分子 NB后，测得溶液的最大吸收波长为524 nm，与未修饰的纳米金溶液最大吸收波长相比红移了5 nm，这可能是由于纳米金颗粒表面通过Au-SH键修饰DNA和 NB后所引起的；图3B显示的是修饰在金颗粒表面的拉曼信标 NB的SERS光谱图，这说明了拉曼信标 NB和巯基DNA都被成功修饰在了金颗粒的表面。

3.4 报告探针浓度的优化

报告探针AuNPs@ NB@DNA的浓度对方法的信背比有一定的影响，对其进行了优化。在固定细菌DNA的浓度为50 nmol/L时，检测了报告探针AuNPs@ NB@DNA浓度分别为2， 4， 6， 8和10 μmol/L （以拉曼染料 NB的浓度为基准）体系的SERS光谱，获得了5组空白组和实验组的光谱图。分别计算了实验组和空白组的SERS

光谱的特征峰（拉曼位移为1333 cm

处的特征峰）的峰强，由此得到了不同报告探针浓度所对应的信背比，如图4所示。

3.5 多种不同的拉曼染料验证实验现象

为了进一步对实验现象进行验证，选定了多种非荧光型的拉曼染料，如对巯基苯甲酸（4-MBA）、对硝基苯硫酚（NTP）、对巯基苯硼酸（MPBA），进行了相同的实验。制备了3种不同的金纳米颗粒探针（表面修饰不同的拉曼活性染料），分别将其用于细菌DNA的检测，得到了3组空白样品和实验样品。图5是3组样品的SERS光谱图，对于3个不同的空白样品，所得到的拉曼光谱均呈现较弱的SERS响应；而对于3个不同的实验样品，均获得了显著增强的SERS信号，并且不同的染料具有特征的拉曼指纹图谱。

图5 3种金纳米颗粒探针（表面修饰有不同的拉曼活性染料）用于细菌DNA检测的SERS光谱图。（A）对巯基苯甲酸（MBA）；（B）对硝基苯硫酚（NTP）；（C）对巯基苯硼酸（MPBA）。其中，空白样品（a），实验样品（b）

Fig.5 SERS spectroscopy of 3 kinds nanoparticle probes （different Raman active dye modified on the surface） for detection of bacterial DNA. （A） 4-mercaptobenzoic acid （MBA）； （B）4-nitrothiophenol （NTP）； （C）4-sulfanylphenylboronic acid （MPBA）. a， blank sample； b， experimental sample.

图6 浓度为50 nmol/L时，完全互补、单错配、四错配和非互补序列（A，B，C，D）经过相同实验操作后，位于1333 cm

谱峰峰强归一化后的柱状图

Fig.6 Comparison for Raman intensity normalization of sensors hybridized with complementary target （A）， single base mis-matched （B）， four base mis-matched （C） and non-complementary sequence （D） under the same conditions and concentration 50 nmol/L）endprint

3.6 碱基错配的检测

图6所示为相同实验条件下的单碱基错配、四碱基错配、以及完全不互补错配的对照实验。虽然错配序列比空白都显现出了正信号，但是完全不互补错配的寡核苷酸的信号明显来源于背景信号，完全互补的序列产生的信号大于单碱基错配序列的3倍，说明此检测DNA的传感器具有较好的特异性和选择性。

3.7 定量检测

在优化了实验条件后，对不同浓度的细菌DNA的SERS响应进行了考察，图7a是目标探针浓度分别为0，0.005，0.05，0.5，5和50 nmol/L（从下往上）时所得到的SERS谱图。虽然在优化条件下，空白样由于磁珠的非特异性吸附而存在的SERS信号，但是，这样的背景信号对检测并没有产生影响，而且也可以观察到了样品的SERS信号随着细菌DNA浓度的增加而显著增强。图7b是细菌DNA浓度与拉曼位移1333 cm

处的特征峰强度的动态响应曲线，其中每个点均代表在不同的区域10次测量的平均值。图7c是细菌DNA浓度与拉曼位移1333 cm

处的特征峰强度线性关系图，本方法中，DNA浓度在5 pmol/L～5 nmol/L范围内，拉曼强度与细菌其浓度的对数呈现较好的线性关系，线性方程为I=1.919 lgCDNA+1.3907（I为拉曼强度，lgCDNA为细菌DNA浓度的对数），其相关系数为0.9887。

图7 （a）不同细菌DNA浓度所对应的SERS光谱图；（b）拉曼位移1333 cm

处特征峰的峰强度与细菌DNA浓度之间的关系；（c）拉曼位移1333 cm

处特征峰的峰强度与细菌DNA浓度之间的线性关系。

4 结 论

本实验将表面增强拉曼（SERS）传感技术与磁珠分选富集技术相结合，利用纳米金比表面积大、具有良好生物相容性以及表面核酸高负载量的特点，构建一种基于纳米金聚集信号放大的新型SERS传感器。采用三维的磁珠作支撑材料，并通过磁性分离使纳米金聚集，产生“热点”，提高了检测的灵敏度。本方法设计简单，快速，费用低，由于互补DNA链间的杂交特性而具有较高的特异性和选择性，为DNA及其它生物分子的检测提供了一个简单实用的方法。

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