抑制HIF1α表达对低氧培养SGC-7901胃癌细胞CD44表达的影响

梁 赅 杜 伟 李 爽 柯庆华 蔡 君 杨继元

胃癌细胞表面粘附分子CD44+细胞在体内外实验中表现出较强的干细胞特性，如自我更新及强致瘤能力等［1］，提示CD44的表达在胃癌细胞的复发转移机制中发挥了重要的作用。低氧被认为是肿瘤干细胞赖以生存的“小生境”(niche)的重要特性之一［2］，已知低氧对细胞的影响通过低氧诱导因子(hypoxia inducible factors，HIF)发挥调节作用，主要亚型有HIF1α、HIF1β、HIF2α 等。研究表明低氧对肿瘤细胞的影响主要为稳定HIF1α亚型蛋白，抑制其蛋白降解［3］。HIF1α可调节多种靶基因如血管内皮生长因子等的表达，在胃癌细胞复发转移过程中起重要作用［4］，其机制目前仍未完全明确，是否参与调节表面粘附分子CD44的表达未见研究报道。

本研究拟以人胃癌细胞系SGC-7901为研究对象，研究低氧条件下对HIF1α及CD44的表达变化，并用雷帕霉素抑制SGC7901细胞的HIF1α表达，观察对CD44表达的影响，为阐明其分子机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

低分化人胃癌细胞系SGC7901购自武汉大学典藏中心。

1.2 试剂

RPMI-1640培养基(美国GIBCO公司)，青霉素-链霉素双抗(美国GIBCO公司)，小牛血清(GIBCO公司)，雷帕霉素(美国 Sigma公司)，二甲基亚砜(DMSO，美国sigma公司)，逆转录试剂盒(大连宝生物公司);Trizol试剂(大连宝生物公司)，荧光实时定量PCR试剂盒(大连宝生物公司);引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成;CD44、HIF1α多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology，美国);ECL试剂盒(Pierce Biotechnology，美国)。

1.3 仪器

三气培养箱(德国BINDER)、RG-3000实时定量PCR仪(Corkett，澳大利亚);低温离心机(Eppendorf公司，德国);电泳仪及电泳槽(六一仪器厂，北京)。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养 胃癌细胞系 SGC7901培养于含10%小牛血清DMEM培养基中，共分4组:正常及低氧空白对照;正常及低氧雷帕霉素组。分别于正常氧压及含1%O2条件下传代培养1周。随后加入20 nm/L雷帕霉素培养72 h，观察细胞活力，及生长曲线的变化，并收获细胞，进行细胞侵袭能力实验，检测CD44及HIF1α的mRNA及蛋白表达。

1.4.2 细胞生长曲线 采用CCK8法检测细胞生长曲线。将含100 μl细胞混悬液的培养板中，加入含20 nm/L雷帕霉素溶液10 μl，在低氧和正常氧压中培养24、48、72 h，然后加入 CCK8 试剂 10 μl，混匀后培养2 h，酶标仪检测450 nm吸光度值。根据试剂盒方法计算细胞增殖活力。

1.4.3 Transwell试验 Transwell试验用于检测细胞侵袭活性。将Matrigel凝胶加入transwell小室上层，37℃孵育30 min聚合成凝胶，加入含1×105细胞悬液200 μl，放入含培养基的24孔培养板中，培养24 h。随后取出小室，去除基质胶及膜上层细胞，加入MTT试剂，采用间接计数法计算下室细胞数量。

1.4.4 实时荧光定量 PCR检测细胞CD44、HIF1α 基因mRNA的表达 Trizol法提取细胞总RNA，根据逆转录试剂盒提供方法进行逆转录，所得cDNA进行荧光实时定量PCR，反应体系见表1，引物设计及反应条件见表2，根据PCR反应的溶解曲线及曲线特征，评价引物增殖反应的特异性，记录各样本反应的阈值(Threshold cycle，Ct)，参照试剂盒说明书计算目的基因mRNA表达水平。

表1 实时定量PCR反应体系

表2 实时定量PCR寡核苷酸引物及扩增条件

1.4.5 Westen blot检测细胞 CD44 及 HIF1α 蛋白表达 将上述分组培养的细胞去除培养液，加入细胞裂解液，离心后取上清进行蛋白定量。随后进行SDSPAGE电泳，样品经过分离胶及浓缩胶，待溴酚蓝至分离胶下缘时停止电泳，随后进行转膜，将样品蛋白湿转至NC膜上，经过漂洗脱色后，分别加入稀释后的CD44及HIF1α抗体进行一抗封闭(CD44抗体，1∶200;HIF1α抗体，1∶100)，漂洗后再加入二抗孵育，最后在暗室中进行ECL显色。显色结果拍照后采用灰度分析进行半定量分析。

1.5 统计学方法

应用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差(Mean±SD)表示，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，P＜0.05表示差异具有显著性。

2 结果

2.1 低氧条件下SGC7901胃癌细胞增殖活性的变化

与正常对照组对比，低氧条件下细胞增殖活性明显升高(P＜0.05)。雷帕霉素处理SGC7901胃癌细胞培养72 h后，不论在常氧及低氧条件下增殖活性都较对照组下降(P ＜0.05)，见图1。

图1 低氧条件下SGC7901细胞生长曲线

2.2 低氧条件下SGC7901胃癌细胞侵袭能力的变化

与正常对照组比较，低氧条件培养后细胞侵袭活性明显增强(P＜0.05)，雷帕霉素处理后细胞侵袭活性明显下降(P ＜0.05)，见图2。

图2 低氧条件培养SGC7901细胞侵袭活性

2.3 雷帕霉素处理人 SGC7901细胞后 HIF1α及CD44的蛋白表达

与正常对照组比较，低氧条件下培养细胞HIF1α及CD44的蛋白表达水平明显升高(P＜0.05)，而雷帕霉素处理细胞后HIF1α和CD44表达水平均明显降低(P ＜0.05)，见图 3。

2.4 雷帕霉素处理人 SGC7901细胞后 HIF1a及CD44的mRNA表达

与正常对照组比较，低氧条件下培养细胞HIF1α及CD44基因的mRNA表达明显升高(P＜0.01)，而雷帕霉素处理细胞后HIF1α和CD44表达均明显降低(P ＜0.01)，见图4。

图3 低氧条件培养SGC7901细胞HIF1α及CD44的蛋白表达

3 讨论

胃癌是全世界最常见的四大肿瘤之一，虽然近几年来在美国的发生率有下降趋势，但仍是中国及西方国家常见肿瘤疾病［5］。肿瘤干细胞(Cancer Stem Cell)假说是近年来提出的1种新理论，假说认为肿瘤由肿瘤干细胞和一般肿瘤细胞组成(肿瘤的异质性)，肿瘤干细胞是存在于肿瘤组织中的极少的具有自我更新、不定潜能性并促使肿瘤形成的细胞，是形成不同分化程度的肿瘤和肿瘤不断生长扩散的根源［6］。因此肿瘤干细胞理论促使我们重新审视肿瘤起始、发展和治疗中抗药性及放疗耐受的原因。

CD44是1种跨膜糖蛋白，为1种粘附分子。CD44+肿瘤细胞在无血清培养基中成球富集生长，且注射入NOD/SCID小鼠胃中及皮下，可表现出极强的成瘤能力，表现出了其自我更新及分化的干细胞潜能［7］，这些提示CD44在维持其干细胞特性中起重要的作用，有学者提出将CD44作为1种胃癌肿瘤干细胞表面标记物，但其表达调控机制仍不明确。HIF1α参与调节常见肿瘤干细胞标记物CD133的表达［8］，下调CD133过表达细胞系中CD133的表达。Platet等研究表明，HIF1α可介导上调人胶质瘤细胞CD133的表达［9］。

本研究结果表明，低氧条件下胃癌细胞SGC7901增殖及侵袭能力明显增强，下调细胞的HIF1α表达后，能有效降低SGC7901的增殖侵袭能力，并显著降低CD44的表达。由此可推测，低氧可能通过HIF1α调节CD44的表达，调控胃癌细胞增殖及侵袭潜能。而进一步分子信号通路机制还有待后续深入研究。

图4 低氧条件培养SGC7901细胞HIF1α及CD44的mRNA表达

［1］Xue Z，Yan H，Li J，et al.Identification of cancer stem cells in vincristine preconditioned SGC7901 gastric cancer cell line〔J〕.J Cell Biochem，2012，113(1):302-312.

［2］Keith B，Simon MC.Hypoxia-inducible factors，stem cells，and cancer〔J〕.Cell，2007，129(3):465-472.

［3］Hill RP，Marie-Egyptienne DT，Hedley DW.Cancer stem cells，hypoxia and metastasis〔J〕.Semin Radiat Oncol，2009，19(2):106-111.

［4］Wang Y，Li Z，Zhang H，et al.HIF-1α and HIF-2α correlate with migration and invasion in gastric cancer〔J〕.Cancer Biol Ther，2010，10(4):376-382.

［5］Fox JG，Wang TC.Inflammation，atrophy，and gastric cancer〔J〕.J Clin Invest，2007，117(1):60-69.

［6］Reya T，Morrison SJ，Clarke MF，et al.Stem cells，cancer，and cancer stem cells〔J〕.Nature，2001，414(6859):105-111.

［7］Takaishi S，Okumura T，Tu S，et al.Identification of gastric cancer stem cells using the cell surface marker CD44〔J〕.Stem Cells，2009，27(5):1006-1020.

［8］Matsumoto K，Arao T，Tanaka K，et al.mTOR signal and hypoxia-inducible factor-1 alpha regulate CD133 expression in cancer cells〔J〕.Cancer Res，2009，69(18):7160-7164.

［9］Platet N，Liu SY，Atifi ME，et al.Influence of oxygen tension on CD133 phenotype in human glioma cell cultures〔J〕.Cancer Lett，2007，258(2):286-290.