miR-223敲减慢病毒的构建

张欣，关晓慧，王宝利

miR-223敲减慢病毒的构建

张欣，关晓慧，王宝利△

目的构建miR-223敲减慢病毒，为进一步研究miR-223的功能提供工具。方法采用Invitrogen公司miR-RNAi在线设计工具，根据miR-223成熟体序列设计了一对互补寡核苷酸片段，退火产物连接至pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体，经酶切连入pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体，构建了miR-223敲减慢病毒质粒，利用293T细胞将其包装成病毒，并感染ST2细胞，观察感染效率并用qRT-PCR检测miR-223成熟体表达。结果酶切鉴定及测序结果显示成功构建了miR-223敲减慢病毒载体，miR-223敲减慢病毒包装并感染靶细胞，表达绿色GFP荧光蛋白的细胞约占细胞总数的80%～90%，病毒滴度为1×109PFU/mL，感染效率达90%。感染miR-223敲减慢病毒的细胞miR-223表达量（0.31±0.03）低于阴性对照（1.00±0.09），为阴性对照的31%，差异有统计学意义（n=3，t= 15.091，P＜0.05）。结论成功构建了miR-223敲减慢病毒，为进一步研究miR-223的功能准备了条件。

微RNAs；慢病毒属；RNA干扰；慢病毒源性载体；miR-223

近年来microRNA（miRNA）表达及功能的研究成为基因治疗的新热点，有望成为继siRNA后更理想的基因治疗调控表达策略［1］。研究发现miRNA广泛存在于高等真核细胞中，在胚胎发育［2］、细胞增殖与分化［3］、细胞凋亡［4］、细胞代谢［5-6］以及信号转导［7］等多种生命活动中发挥重要作用。miR-223成熟体长度为22个核苷酸（nt），其前体Pre-mir-223为110 nt，成熟体位于其前体茎环结构的3′端，miR-223属于基因间存在的miRNA，位于X染色体，在进化中高度保守［8］。研究发现miR-223与细胞生长、发育、分化、凋亡等过程有关［9］。目前慢病毒源性载体（len⁃tivirus based vector，LV）被广泛用于RNA干扰的研究中，其能将外源基因导入到基因组中，为体外难以转染及原代培养的细胞提供了潜在的传递系统。慢病毒是一类免疫缺陷性病毒，也是一类逆转录病毒载体，在感染过程中可以形成前整合复合体，定位到核孔并进入到细胞核，并稳定整合到基因组上。与质粒载体相比，慢病毒载体具有将外源基因引入分裂及非分裂细胞基因组并持续稳定表达的优势，并具有转染效率高等优点［10］。因此，慢病毒载体被认为是目前进行RNA干扰的首选载体。本论文旨在构建miR-223敲减慢病毒载体，为进一步研究miR-223的功能提供基础，并为构建敲减慢病毒提供方法和工具。

1 材料与方法

1.1材料pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒（美国Sys⁃tem Biosciences公司）；pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体（美国Invitrogen公司）；293T细胞、Stabl3感受态由本实验室提供；T4DNA连接酶、限制性内切酶SalⅠ、ClaⅠ、XhoⅠ、NdeⅠ（美国Fermentas公司）；高纯度质粒小提试剂盒、快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、无内毒素质粒小提试剂盒均购自北京康为世纪生物技术公司；GM easy慢病毒包装试剂盒（吉满生物科技公司）；高效率逆转录试剂盒、2×SYBR Mix（Themo）；引物合成和测序由Invitrogen公司完成。

1.2方法

1.2.1敲减序列的设计采用Invitrogen公司miR-RNAi在线设计工具，根据miR-223成熟体序列设计一对大部分互补寡核苷酸片段，正义链5′-TGCTGTGGGGTATTTGACAAACTGAC AGTTTTGGCCACTGACTGACTGTCAGTTTCAAATACCCCA-3′，反义链5′-CCTGTGGGGTATTTGAAACTGACAGTCAGT CAGTGGCCAAAACTGTCAGTTTGTCAAATACCCCAC-3′，其正义链前4个碱基5′-TGCT为悬挂末端，斜体部分为miR-223成熟体的互补链，中间部分为环结构，黑体部分为中间缺少2个碱基的成熟体序列。反义链除5′端的CCTG为悬挂末端外，其余部分为正义链互补序列。每条寡核苷酸用水溶解为50 μmol/L。在0.2 mL EP管中加入等量该对互补寡核苷酸片段，充分混匀后于PCR仪上进行退火反应：95℃2 min，50℃2 min，3个循环，最后冷却至4℃，得到的退火产物为敲减序列。

1.2.2克隆敲减序列连接至pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体，反应体系：敲减序列2 μL，pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体2 μL，10×T4 ligase Buffer 1 μL，T4 ligase（200 U/μL）1 μL，ddH2O 4 μL，16℃连接过夜。用热激法转化DH5α感受态细胞，取2µL连接产物加入到刚刚解冻的50 μL DH5α感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴10 min，42℃热激40 s，立即置于冰上2 min，加300 μL LB培养基，200 r/min、37℃孵育1 h，将预培养的菌液4 000 r/min离心5 min，弃掉上清，留取100 μL培养基悬浮菌液，均匀涂于LB/壮观霉素固体培养板上，37℃培养过夜。于固体培养板上挑取单菌落摇菌过夜，菌液送测序，测序结果正确的克隆提取质粒（命名为pGW-223-mir）。pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP经ClaⅠ/SalⅠ双酶切电泳回收大片段，pGW-223-miR经ClaⅠ/XhoⅠ双酶切电泳回收小片段，XhoⅠ和SalⅠ为同尾酶，pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体上的ClaⅠ位点经诱变得到，位于CMV promoter序列前。用T4 ligase把pGW-223-mir回收小片段及pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体回收大片段于16℃连接过夜，转化Stabl3感受态细胞，均匀涂于LB/氨苄青霉素固体培养板上，37℃培养过夜，于固体培养板上挑取单菌落37℃摇菌过夜，提取质粒（命名为miR-223 KD LV）。NdeⅠ单酶切鉴定，37℃，15 min。酶切鉴定正确后送测序，测序结果正确的克隆，-80℃冻存备用。

1.2.3慢病毒的包装与浓缩慢病毒包装前24 h，293T接种至10 cm培养皿中，细胞汇合度达到70%～80%时适宜转染。转染前1 h将更换新鲜DMEM培养基（含10%FBS，不含双抗），12 mL/10 cm培养皿。转染体系：DMEM 1 mL，miR-223 KD LV/pCDH（又命名control LV）10 μg，GM easy Lentiviral Mix 10 μL，HG Transgene Reagent 60 μL。混匀后，室温放置20 min后，均匀滴加到细胞培养基中，随后置于37℃5%CO2培养箱中培养。转染16～20 h后，小心吸掉细胞培养液，弃于盛有消毒液的废液杯中，然后加10 mL新鲜的培养基继续培养。换液48 h后，吸取细胞上清液于50 mL离心管，4℃1 000 r/min离心10 min，上清液加入Amicon. Ultra-15浓缩柱中，4 000×g离心25 min，得到约250 μL病毒浓缩液，测定慢病毒滴度。方法如下：转染前，将生长状态良好的293T以1×105/mL密度接种至96孔板，100 μL/孔，共10孔。于37℃5%CO2培养箱中继续培养。在1.5 mL无菌EP管中对病毒浓缩液以10倍梯度进行倍比稀释，连续10个稀释度。稀释方法如下：10个1.5 mL无菌EP管中各加入90 μL DMEM完全培养基并进行编号，向第1个管中加入10 μL病毒浓缩液，混匀后吸取10 μL加入第2个管混匀。依次类推，做10个稀释度。弃掉96孔板中原有的培养基，加入稀释好的病毒液。感染24 h后，每孔更换100 μL DMEM完全培养基，利于细胞生长。感染第4天于荧光显微镜下观察各孔含荧光的细胞数并收集浓缩后的miR-223敲减慢病毒及其阴性对照感染293T细胞，上清液浓缩后进行滴度测定，于倒置荧光显微镜下观察并计算感染效率，感染效率指荧光细胞占总细胞的百分比。

1.2.4miR-223敲减慢病毒效率miR223敲减慢病毒及其阴性对照慢病毒感染ST2细胞48 h后，用E.Z.N.A.TMmiRNA Kit（OMEGA）提取miRNA，高效率逆转录试剂盒（GeneCopoe⁃ia）反转录成cDNA。PCR反应体系：总体积20 μL，含2× SYBR mix 10 μL，miR-223上下游引物或内参照基因U6上下游引物（2 μmol/L）各2 μL，cDNA 3 μL，双蒸水3 μL，其中引物购自GeneCopoeia公司。实时定量PCR（qRT-PCR）反应条件：50℃2 min，95℃1 min，（94℃30 s，60℃15 s，72℃15 s）共40个循环，72℃5 min。反应结束后根据熔解曲线分析证实产物特异性，以U6作为内参，待测样品2-△△CT值表示目的基因相对表达量［4］（CT是每个反应管内的荧光信号到达一定阈值时所经历的循环数；样品△CT=目的基因CT值-U6CT值），所有实验重复3次以上。

1.3 统计学方法采用SPSS 16.0软件进行统计处理。计量资料数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1miR-223敲减慢病毒表达载体的构建pGW-223-mir重组载体测序正确，miR-223 KD LV重组载体经NdeⅠ单酶切，其酶切鉴定及测序结果均显示载体构建成功，见图1。重组慢病毒的表达框包括：CMV Promoter、EmGFP报告基因、5′miRNA flanking region、插入的敲减序列、3′miRNA flanking region和转录终止序列。

Fig.1NdeⅠenzyme digestion of miR-223 KD LV recombinant vector图1 miR-223 KD LV重组载体NdeⅠ单酶切鉴定图（箭头所示为目的片段）

2.2miR-223敲减慢病毒包装并感染靶细胞荧光显微镜下可见表达绿色GFP荧光蛋白的细胞约占细胞总数的80%～90%，细胞生长良好，见图2。

Fig.2The 293T transfected with lentiviral expression plasmids of miR-223 KD LV and control LV（×100）图2 miR-223 KD LV与control LV慢病毒表达质粒转染293 T（×100）

2.3滴度测定病毒滴度为1×109PFU/mL，按照感染复数（MOI）=10感染ST2，可见2组细胞感染效率相似，表达绿色GFP荧光蛋白的细胞约为细胞总数的90%，见图3。

Fig.3The ST2 cells infected with lentiviral of miR-223 KD LV and control LV（×100）图3 miR-223 KD LV与control LV慢病毒感染ST2（×100）

2.4miR223敲减慢病毒效率感染miR-223敲减慢病毒的细胞miR-223表达量（0.31±0.03）低于阴性对照（1.00±0.09），为阴性对照的31%，差异有统计学意义（n=3，t=15.091，P＜0.05）。

3 讨论

miRNA是一类非编码的小单链RNA，其长度为18～25 nt，它是由DNA转录产生，但是并不翻译成蛋白质。在动物细胞miRNA主要通过与位于靶mRNA的3′非翻译区（3′UTR）的互补序列结合而阻断翻译，在转录后水平调控基因的表达，miRNA序列在进化中具有高度的保守性，其表达具有发育时序性和组织特异性［11］。

本实验选用了Invitrogen公司设计的miRNA干扰质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR作为中间载体，它包含的CMV启动子具有高效持久启动的特点，并带有壮观霉素抗性，便于原核和真核的筛选，并且带有EmGFP绿色荧光蛋白，便于对后续转染效率的观察。病毒载体具有转染效率高、持续时间长，并能在哺乳动物各类细胞中稳定表达siRNA，长期抑制基因表达，这也是病毒作为载体的一大优势。在病毒包装过程中应注意细胞种植密度、细胞活力及病毒的收集时机，这些因素都将直接关系到后期的干扰效果。

在新构建的载体中，重组慢病毒的表达框包含CMV Promoter、EmGFP报告基因、5′miRNA flanking region、插入的敲减序列、3′miRNA flanking region和转录终止序列。插入的敲减序列的转录本类似miRNA的茎环序列，按照miRNA的剪切方式进行剪切，类似siRNA的工作模式，通过结合互补的miR223成熟体，使其不能结合蛋白而阻断翻译。近年来研究发现miRNA调控β-catenin的Wnt信号通路［12］，miR-223的靶基因及其作用机制需要进一步的研究。

为了进一步研究miR-223的功能，本实验中采用慢病毒载体敲减miR-223在细胞中的表达，慢病毒的感染效率很高，能达到90%。qRT-PCR结果显示：与阴性对照组相比，感染miR-223敲减慢病毒的细胞miR-223表达显著下降，为阴性对照组的31%。表明成功构建了miR-223敲减慢病毒载体，采用本方法构建敲减慢病毒载体，对目的miRNA敲减有效，在miRNA研究中值得应用。

［1］Piva R，Spandidos DA，Gambari R.From microRNA functions to mi⁃croRNA therapeutics:Novel targets and novel drugs in breast can⁃cer research and treatment［J］.Int J Oncol，2013，43（4）:985-994.doi:10.3892/ijo.2013.2059.

［2］Laurent LC.MicroRNAs in embryonic stem cells and early embryon⁃ic development［J］.Cell Mol Med，2008，12（6）:2181-2188.doi: 10.1111/j.1582-4934.2008.00513.x.

［3］Guo L，Zhao RC，Wu Y.The role of microRNAs in self-renewal and differentiation of mesenchymal stem cells［J］.Exp Hematol，2011， 39（6）:608-616.doi:10.1016/j.exphem.2011.01.011.

［4］Riley KJ，Rabinowitz GS，Yario TA，et al.EBV and human microR⁃NAs co-target oncogenic and apoptotic viral and human genes dur⁃ing latency［J］.EMBO J，2012，31（9）:2207-2221.doi:10.1038/em⁃boj.2012.63.

［5］Jansson MD，Lund AH.MicroRNA and cancer［J］.Mol Oncol，2012，6（6）:590-610.doi:10.1016/j.molonc.2012.09.006.

［6］Lima RT，Busacca S，Almeida GM，et al.MicroRNA regulation of core apoptosis pathways in cancer［J］.Eur J Cancer，2011，47（2）: 163-174.doi:10.1016/j.ejca.2010.11.005.

［7］Croce CM.Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer［J］.Nat Rev Genet，2009，10（10）:704-714.doi:10.1038/ nrg2634.

［8］Fukao T，Fukuda Y，Kiga K，et al.An evolutionarily conserved mechanism for microRNA-223 expression revealed by microRNA gene profiling［J］.Cell，2007，129（3）:617-631.doi:10.1016/j.cell. 2007.02.048.

［9］Ma X，Zhou J，Zhong Y，et al.Expression，regulation and function of microRNAs in multiple sclerosis［J］.Int J Med Sci，2014，11（8）:810-818.doi:10.7150/ijms.8647.

［10］Nasri M，Karimi A，Allahbakhshian Farsani M.Production，purifica⁃tion and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery pur⁃poses［J］.Cytotechnology，2014，66（6）:1031-1038.doi:10.1007/ s10616-013-9652-5.

［11］Tsai ZY，Singh S，Yu SL，et al.Identification of microRNAs regulat⁃ed by activin A in human embryonic stem cells［J］.J Cell Bio⁃chem，2010，109（1）:93-102.doi:10.1002/jcb.22385.

［12］Stepicheva N，Nigam PA，Siddam AD，et al.microRNAs regulate βcatenin of the Wnt signaling pathway in early sea urchin development［J］.Dev Biol，2015，402（1）:127-141.doi:10.1016/j.ydbio.2015.01.008.

（2014-11-05收稿 2015-03-06修回）

（本文编辑 陈丽洁）

Establishment of miR-223 knockdown lentivirus

ZHANG Xin，GUAN Xiaohui，WANG Baoli△
Key Laboratory of Hormones and Development（Ministry of Health），Metabolic Diseases Hospital&Institute of Endocrinology，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China△

ObjectiveTo construct miR-223 knockdown lentivirus vector and provide a tool for further study of the function of miR-223.MethodsAccording to the Invitrogen miR-RNAi online design tool，a pair of complementary oligo⁃nucleotides encoding miR-223 mature sequence was designed，annealed and ligated with pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR vec⁃tor.Then miR-RNAi expression cassette was cut and subcloned into lentiviral pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP vector.The lentiviruses were packaged and titered，and then ST2 cells were infected with viruses.The efficiency of infection was calcu⁃lated，and the knockdown of endogenous miR-223 was detected by using real-time RT-PCR.ResultsRestriction enzyme digestion and sequencing results showed that miR-223 lentivirus construct was successfully made.Lentivirus that knock⁃down miR-223 expression packaged and infected of target cells.The expression of GFP green fluorescent protein accounted for 80%-90%and the virus titer was 1×109PFU/mL.The infection efficiency reached 90%.Compared with negative control virus，miR-223 knockdown lentivirus significantly down-regulated the expression of miR-223 in ST2，and was 31%（n=3，t= 15.091，P＜0.05）.ConclusionmiR-223 knockdown lentivirus is successfully made.It provides a tool for further studying the function of miR-223.

microRNAs；lentivirus；RNA interference；lentivirus based vector；miR-223

Q524.6

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.07.004

国家自然科学基金资助项目（81271977，81472040）

天津医科大学代谢病医院内分泌研究所、卫生部激素与发育重点实验室（邮编300070）

张欣（1985），女，助理实验师，硕士，主要从事生物化学与分子生物学研究

△通讯作者E-mail：bliwang72@163.com