浅谈蛋白质印迹法操作过程中的实验技巧

宋亮　陈丹丹

摘 要：蛋白质印迹法（蛋白免疫印迹）即Western Blot，是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。其基本原理是将电泳分离后的细胞或组织蛋白从凝胶转移到固相支持物上，然后用特异性抗体对相应抗原进行着色，随后通过分析着色的位置和着色深度来反映蛋白质表达情况。该文通过介绍实验操作过程中的一些心得体会，简要阐述如何提高蛋白质印迹法的实验效果。

关键词：蛋白印迹法 实验技巧 生物学

中图分类号：Q81 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2015）07（c）-0063-02

蛋白质印迹法是分子生物学和生物化学中常用于分离和识别特异性蛋白的一种实验方法。这项技术主要包括三个主要步骤：（1）基于分子重量，利用电泳进行蛋白分离。（2）将蛋白从凝胶转移至固相支持物。（3）利用特异性的一抗和二抗使目的蛋白显色。随后通过分析着色的位置和着色深度来反映蛋白质表达情况。Western Blot实验简单而又复杂，简单在于原理和操作过程，复杂在于每一步的精细化操作，常常一个很小环节的疏忽就会对最终结果产生很大的影响。该文中，作者结合自身多年的实验经历，简要谈谈如何提高蛋白质印迹法的效果。

1 制胶

市售的成品胶简单，省时，效果佳，但价格相对昂贵，因此多数实验室仍选择使用聚丙烯酰胺自行配胶。由于凝胶的质量会直接影响后续的实验，因此要特别注意以下几点。（1） 液态的分离胶及浓缩胶均可事先配好，四甲基乙二胺（TEMED）及10% 过硫酸铵（APS）除外，过滤后作为储存液避光存放于4℃，临用前取出室温平衡，否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡。（2）APS的使用比例大约0.7～0.8：100，通常情况下分离胶浓度越高，使用的APS浓度应越低。（3） APS一定要新鲜，最好现配现用，如在4℃存放，勿超过两周。也可将配好的APS分装后冻存在-20℃，随时取用。（4）混合好的凝胶要均一没有气泡，否则影响聚合，导致电泳带畸形。（5） 灌好胶后需等待其完全凝固才可上样，具体凝固时间与加入的APS及TEMED配比有关，通常在0.5～1 h内凝集最好。过快表示APS和/或TEMED用量过多，此时胶太硬易裂，而且电泳时容易烧胶。过慢则表明两种试剂用量不够。需要注意的是，胶结构的完全形成需要较长时间，肉眼观察到胶凝时，其内部分子的排列实际尚未完成。因此也可提前一天制胶，保湿放置在4℃过夜，次日使用。

2 上样电泳

制胶完成后，可使用提前变性好的蛋白样品上样电泳。上样前蛋白样品最好瞬时离心，随后轻微混匀。加样时间要尽量短，以免样品扩散。为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液。另外，上样量不宜过多，以免蛋白条带过于臃肿，影响美观。随后，只需要控制好电流强度，根据预染的蛋白Marker判断目的蛋白的位置，适时终止电泳即可。有观点认为分离胶的下1/3处是最佳分辨区，个人经验是1/2处至下1/3处区别不大，考虑到蛋白的区分主要依靠分离胶的浓度，所以在此区间可随时停止电泳，只需注意不要让目的蛋白过于靠近凝胶的下缘或是移动出凝胶就行。电泳过程中有时会出现一些异常现象，如：（1）条带呈笑脸状（︶），这是由于凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。（2）条带呈皱眉状（︵），可能是装置不合适，或是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或两边聚合不完全。（3）条带出现拖尾，提示蛋白样品溶解不好。（4）条带出现纹理（纵向条纹）：可能是样品中含有不溶性颗粒。（5）条带偏斜，是由于电极不平衡，或加样位置偏斜。（6）条带向两边扩散：提示加样量过多。

3 转膜

经过电泳分离后的蛋白质样品需要经过“转膜”步骤，即从凝胶转移到膜上固定，才能用后续方法进行蛋白的检测和显色。为了防止已经分离的蛋白条带在没有电场的情况下扩散，转膜需要尽快进行。不论使用湿转还是半干转，转膜过程中特别需要注意的是两个问题：（1）正确放置“三明治”的叠放次序，即：阳极、下层滤纸、膜、胶、上层滤纸、阴极。（2）仔细排除每层之间的气泡，尤其是膜与胶之间的气泡。大的气泡可能会造成系统短路，小的气泡则会影响蛋白质成功转移至膜上。至于转膜的时间和电流大小，需要根据目的蛋白的分子量进行调整。为防止转膜过程中过多的热量产生，可以提前将转膜液放置在4℃预冷，并且在转膜过程中使用冰盒降温，从而改善转膜效果。转膜结束后可使用丽春红S对膜直接染色来显示蛋白条带，从而检测转膜效果，它的好处是充分脱色后不会干扰后续的抗体孵育。

4 封闭、抗体孵育及发光鉴定

为了减少抗体孵育后的非特异条带以及杂乱的背景，转膜结束后需利用封闭液进行处理，以封闭膜上剩余的疏水结合位点。最常用的封闭液是脱脂奶粉，这是因为脱脂奶粉内的非特异性成分丰富，封闭效率高。需要注意的是，由于抗磷酸氨基酸抗体可以与牛奶中的某些成分结合，所以在检测这些抗体时，不能使用脱脂奶粉作为封闭液，而需换用牛血清白蛋白 （BSA） 进行处理。封闭结束后就是决定蛋白质印迹法成败的关键――使用针对于目的蛋白的一抗进行杂交。对于国内的大多数实验室来讲，选择抗体是个头疼的问题。原因很简单，进口抗体，如Abcam，Cellsignaling和Sigma的一抗虽然效果好，但是价格昂贵。相比之下，Santa Cruz的抗体则量大，价位也便宜些，性价比较高。至于进口抗体国内分装，或纯国产抗体，质量则良莠不齐，购买时需要些勇气及运气。因此选择一抗前最好根据发表的文献来查找有效的抗体，慎重选择。至于抗体（包括一抗及二抗）浓度一般要参照抗体说明书多次尝试，选择最适比例，合适的比例直接影响实验结果以及背景。此外，加一抗、二抗要严格保证反应时间，洗膜要注意尽可能地将一抗、二抗洗净，有利于降低背景。抗体孵育结束后，一般使用辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法或碱性磷酸酶AP-NBT/BICP显色法进行发光鉴定。无论什么方法，都需要根据结果调整曝光或者显色时间，达到最佳效果。

5 结语

虽然在蛋白印迹的操作过程中使用相应技巧可以改善实验效果，但一抗的质量，以及待检测蛋白的提取质量才是实验成功的决定性环节，应受到充分重视。

参考文献

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