环丙沙星和四氰基乙烯的荷移反应及其荧光特性的研究

巩忠萍，杜梦圆，宋 笛，高蕻冰，杜浩然，于莉莉，吴 江，吕奎霖，葛争红，石春卉，李 烨，吕玉光

(1.佳木斯大学 药学院，黑龙江佳木斯，154007;2.佳木斯大学 国际教育学院，黑龙江佳木斯，154007;3.佳木斯大学口腔医学院，黑龙江佳木斯，154002;4.北京化工大学材料科学与工程学院，北京100029;5.北京联合大学生物化学工程学院，北京100101)

环丙沙星作为第3代喹诺酮类药物的典型代表之一，具有抗菌谱广，毒副作用小，血药浓度高，半衰期长，制剂形式多样，药效价格比高等特点［1］，使其广泛应用于临床治疗中.与此同时发展出了一系列的检测环丙沙星方法，例如有分光光度法［2－3］、高效液相色谱法［4－6］和荧光光度法［7］.在 Mulliken 等［8］首次提出了电荷转移络合物理论后，许多人对这一理论进行了深入的研究.电荷转移络合物(charge transfer complex，CTC)是由富含电子的分子和缺电子物质之间通过电荷转移而构成的络合物［9］.由于许多药物中含有富电子基团(氨基、吡啶等)，因此能够与电子受体(四氰基乙烯等)形成稳定的荷移络合物［10］，且基于此理论方法进行的药物定量分析法具有简便准确，灵敏度高等特点［11－12］.应用荷移反应对喹诺酮类药物含量测定的方法研究多限于分光光度法［13］，而采用荧光光谱对喹诺酮类药物荷移反应的研究还很少被报道.

基于此，选取四氰基乙烯为电子受体试剂来和环丙沙星构筑荷移络合物，研究其最佳合成条件.通过体系的荧光增强效应，建立了新型的检测环丙沙星药物的新方法.同时，还对其荷移络合物的形成机理进行了研究.

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

970CRT荧光分光光度计(上海仪器分析制作总厂);UV/Vis－265紫外－可见光分光光度计;环丙沙星标准溶液:准确称取10 mg的环丙沙星标准品(中国药品生物制品检定所，批号:00120000，纯度≥99.0%)，加少量甲醇溶解，配置成100 mg/L的标准溶液，使用时逐级稀释至所需浓度;四氰基乙烯标准液:准确称取64 mg四氰基乙烯标准品，加少量丙酮溶解，配置成5×10－3mol/L的标准溶液;所用其余试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水.

1.2 实验方法

在10 mL具塞比色管中用移液管准确吸取适量环丙沙星甲醇溶液，然后分别加入2.5mL的四氰基乙烯工作液，然后用无水甲醇定容至刻度线，充分摇匀.将其置于40℃的恒温水浴箱中加热40 min.冷却至室温.将样品置于荧光比色池中，以331 nm为激发波长，与437 nm处测量荷移络合物的荧光强度.以同样的方法进行空白试验.

2 结果与讨论

2.1 环丙沙星荷移反应前后的荧光激发和发射光谱和紫外光谱

按实验方法配制试液，分别对所得荷移反应产物和环丙沙星和空白试剂进行荧光激发和发射扫描(见图1).由图1可知，环丙沙星自身能发射荧光.当与四氰基乙烯发生荷移反应后，荧光激发和发射峰的位置变化不大，但荧光强度却显著增强，这表明环丙沙星与四氰基乙烯荷移络合物的生成.

按实验方法配置溶液后，在UV/Vis－265分光光度计上扫描，绘制吸收光谱如图2所示，表明络合物在409 nm处有最大吸收峰，而TCNE和CPFX的最大吸收峰分别位于328 nm和327 nm，说明了荷移络合物的形成.

2.2 四氰基乙烯用量的影响

分别取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL的四氰基乙烯加入到含有4 mL环丙沙星的比色管中，用甲醇定容至刻度线，摇匀，40℃水浴中保温40 min，冷却至室温，测定荧光强度，结果如图3所示.实验结果表明:当四氰基乙烯的用量在0.3 mL时荧光增强最大.用量过低则反应不完全;而用量高时导致荧光强度下降.

2.3 环丙沙星用量的影响

分别取 1，2，3，4，5，6，7，8 mL 的环丙沙星溶液到含有0.3 mL四氰基乙烯的比色管中，用甲醇定容至刻度线，摇匀，40℃水浴中保温40 min，冷却至室温，测定荧光强度，结果如图4所示.实验结果表明:当环丙沙星的用量在4 mL时荧光增强最大.

2.4 反应温度的影响

按实验方法，在固定其他实验条件不变的情况下，考察温度对荧光强度的方法.选取最佳的试剂质量浓度分别加至不同的比色管中，然后置于不同的恒温水浴锅中，控制温度分别为 20、30、40、50、60 ℃加热40 min.结果如图5所示，结果表明当温度处于40℃以下时，体系的荧光强度随着温度的增高而依次增强.但在40℃后体系的荧光强度逐渐稳定.本实验选择40℃为最佳反应温度.

2.5 反应时间的影响

选取确定的最佳实条件，考察反应时间对荷移络合物的影响.选取最佳反应质量浓度的试剂置于不同比色管中，控制温度在40℃，反应时间分别为10、20、30、40、50、60 min，其荧光强度变化如图 6 所示，环丙沙星与四氰基乙烯发生电荷转移反应最佳反应时间为40 min.

2.6 标准曲线与检出限

准确配置质量浓度为1.0～100 mg/L的环丙沙星溶液，按上述建立的实验方法，对不同质量浓度的荷移络合物体系进行荧光光谱扫描，选取最佳的实验条件，结果表明环丙沙星质量浓度－荧光强度曲线中当环丙沙星质量浓度为0.2～8.1 mg/L的范围内呈良好的线性关系，线性回归方程为F=139.2ρ+2.564 1;相关系数r=0.999 4;检出限为0.2 mg/L.

2.7 反应机理初探

四氰基乙烯是一个很强的平面型π电子受体，而环丙沙星分子中的哌嗪基上的氮原子有一对孤对电子，可作为电子供体，与四氰基乙烯形成1∶1的n－π型荷移络合物，其形成过程可表示如图7所示.

3 样品分析

在丙酮－甲醇介质中，环丙沙星能与四氰基乙烯形成稳定的电荷转移络合物，最佳的反应温度为40℃，反应时间为40 min，其荧光强度较环丙沙星有显著的提高.因此，该法可作为用于测定药物中环丙沙星的含量的新方法，且反应条件温和，速度快，灵敏度高.

3.1 待测样品溶液的配置

分别取2个不同厂家生产的盐酸环丙沙星片剂10片，经过准确称量记录后，研成粉末状.准确称取其总质量的1/10，用甲醇溶液溶解，精密称取滤液5 mL，用甲醇定容至100 mL容量瓶中，备用.

3.2 样品测定及回收率

分别量取适量的盐酸环丙沙星样品溶液，置于10 mL比色管中，按照上述实验所确定的最佳条件和方法，计算出样品实际含量.准确量取适量的盐酸环丙沙星对照品，通过荧光强度来计算回收率，结果表1所示.

本方法和药典法无系统误差，回收检验结果令人满意，其回收率为97.69% ～100.12%;相对标准偏差小于2.5%.

4 结语

在丙酮－甲醇介质中，环丙沙星能与四氰基乙烯形成稳定的电荷转移络合物，最佳的反应温度为40℃，反应时间为40 min，其荧光强度较环丙沙星有显著的提高.因此，该法可作为用于测定药物中环丙沙星的含量的新方法，且反应条件温和，速度快，灵敏度高.

表1 盐酸环丙沙星片剂分析结果(n=5)

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