黄绿蜜环菌菌种分离及人工培养研究

史强强，党　军，苑　祥，岳会兰，王启兰（.中国科学院西北高原生物研究所，中国科学院藏药研究重点实验室，青海西宁80008；2.中国科学院大学，北京00049）

黄绿蜜环菌菌种分离及人工培养研究

史强强1，2，党军1，苑祥1，2，岳会兰1，王启兰1
（1.中国科学院西北高原生物研究所，中国科学院藏药研究重点实验室，青海西宁810008；2.中国科学院大学，北京100049）

采用组织分离法从黄绿蜜环菌子实体的菌盖与菌柄结合处分离菌种，经多次纯化，获得纯化的黄绿蜜环菌菌株。以分离的黄绿蜜环菌母种为材料，通过单因素实验和正交实验，以菌落直径及菌丝体干重为指标，研究不同碳源、氮源、无机盐、维生素对菌丝体生长的影响。结果表明：黄绿蜜环菌菌丝最优化培养条件为马铃薯浸出液20%、黄豆芽浸提液10%、KH2PO40.3‰、VB1+VB21 mg/L（等比例），在此培养条件下，黄绿蜜环菌菌丝体干重可达6.5 mg/mL。

黄绿蜜环菌，菌种分离，人工培养

黄绿蜜环菌（Armillaria luteo-virens），又名黄蘑菇，黄环菌，属担子菌门（Basidiomycota），层菌纲（Hymenomycetes），伞菌目（Agaricales），口蘑科（Tricholomataceae），蜜环菌属（Armillaria）。主要分布于我国青海、四川、甘肃、西藏等地区，是高山草地上的一种名贵的珍稀野生食用菌［1-4］。黄绿蜜环菌目前仍处于野生状态，资源量非常有限，被青海和西藏区的居民广泛采食。由于黄绿蜜环菌集食用、药用和保健功能于一身，深受消费者的青睐，市场需求量逐年增加，目前市场干品价可达1000元/kg，出口价更加昂贵。黄绿蜜环菌被公认为是最有开发利用价值的野生菌类之一。对于黄绿蜜环菌菌丝体培养条件的初步研究［6］、人工培养条件方面的研究［7-8］及深层发酵条件的研究［9］，已有相关文献的报道。但是人工培养对其有效成分的开发研究尚属起步阶段，对黄绿蜜环菌菌丝体的人工培养也没有系统的研究。如何经济有效地进行生物活性组分的提取、利用，已成为黄绿蜜环菌深加工的重要研究内容之一。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

黄绿蜜环菌采自青海省海北州、果洛、黄南、玉树等地的黄绿蜜环菌子实体，除去子实体表面的异物及菌柄基部的泥土，装入编号的牛皮纸袋内，带回实验室备用；葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉天津市永大化学试剂有限公司；KH2PO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4、CuSO4、MnSO4、（NH4）2SO4、FeSO4、KNO3、NH4NO3、NH4Cl、CaCl2、VB1、VB2、复合VB上海化学试剂总厂；蛋白胨、酵母粉、琼脂北京双旋微生物培养基制品厂；马铃薯、黄豆芽新鲜市售。

AG204型电子天平METTLER TOLEDO公司；LHS-250SC型恒温恒湿培养箱上海一恒科技有限公司；HVE-90型高压灭菌器日本HIRAYAMA公司；BCM-1000型超净工作台苏州净化设备有限公司；BHF-T型生物显微镜日本OLYMBUS公司；UPI-1-520T型超纯水器成都超纯科技有限公司；DZF-6050型真空干燥箱上海精宏实验设备有限公司；HYG-A型全温摇瓶柜太仓市实验设备厂。

1.2实验方法

1.2.1黄绿蜜环菌菌种分离与纯化

1.2.1.1分离纯化用培养基配方去皮马铃薯浸出汁20%，葡萄糖2%，酵母浸出汁1‰，微量盐，微量复合VB，琼脂1.8%，蒸馏水，pH6.5。

1.2.1.2分离纯化黄绿蜜环菌菌种采用组织分离法从子实体的菌盖与菌柄结合处分离菌种。从中选取无污染、生长健壮的菌株，经多次纯化，最终获得纯化的黄绿蜜环菌菌株4株，经鉴定为黄绿蜜环菌菌株。分别编号为AM-H（海北）、AM-N（黄南）、AM-G（果洛）、AM-Y（玉树），接种于试管斜面。从分离纯化的菌种中筛选出长势及适应性较好的菌株，作为人工培养材料。

1.2.2黄绿蜜环菌菌种的培养及其适应性研究以分离的黄绿蜜环菌母种（AM-H）为材料，经过PDA培养基（马铃薯葡萄糖琼脂培养基）多次传代培养，获得AM-H菌株。

利用平板培养测定菌落生长速度（以培养15 d最大直径Φ mm为指标）；通过100 mL液体培养基培养测定菌丝体生产量（以培养15 d所获得的菌丝体干重为指标），研究不同碳源、氮源、无机盐、维生素对菌丝体生长的影响。

1.2.3单因素实验

1.2.3.1不同碳、氮源对黄绿蜜环菌菌丝生长的影响

在无碳源基础培养基（硝酸铵0.3%、硫酸镁0.3‰，氯化钙0.15‰，磷酸二氢钾0.3‰，硫酸亚铁0.05‰，复合VB微量，蒸馏水，pH6.5）中，分别添加2%的葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖、马铃薯作为碳源，连续培养15 d，测定菌丝体生长的直径，然后将菌丝体用蒸馏水清洗干净，洗去表面粘附的培养基，烘干，称重，得菌丝体干重，考察不同碳源对菌丝生长的影响。

大学生在日常行为中会直接体现出学生对于社会主义核心价值观的坚持。所以大学生的日常行为规范是实行核心价值观的基础前提。教师要引导学生在日常生活中规范自己的行为，只有这样才能让学生做到修身立德。比如学生在日常生活中可以做到与其它同学和睦相处，不要寻衅滋事，这就做到了核心价值中的“和谐”，又比如说教师可以引导学生时刻有一颗“法治”的心，在遇到打架、偷窃或者其它违法事件时要主动报案，让法律来处理问题，不要选择避让无视〔6〕。

在无氮源基础培养基（葡萄糖1.5%、硫酸镁0.3‰，氯化钙0.15‰，磷酸二氢钾0.3‰，硫酸亚铁0.05‰，复合VB微量，蒸馏水，pH6.5）中，分别添加0.4%的蛋白胨、10%黄豆芽浸提液、0.3%硝酸铵、0.2%硝酸钾、0.2%氯化铵作为氮源，连续培养15 d，测定菌丝体生长的直径，然后将菌丝体用蒸馏水清洗干净，洗去表面粘附的培养基，烘干，称重，得菌丝体干重，考察不同氮源对菌丝体生长的影响。

1.2.3.2无机盐及维生素对黄绿蜜环菌菌丝生长的影响在没有无机盐及维生素的马铃薯葡萄糖培养基中（葡萄糖1.5%、硝酸铵0.3%、蒸馏水，pH6.5），分别加入0.3‰的硫酸镁、硫酸铜、硫酸锰、硫酸亚铁、硫酸锌，以无矿质元素的马铃薯葡萄糖培养基为对照，连续培养15 d，测定菌丝体生长的直径，然后将菌丝体用蒸馏水清洗干净，洗去表面粘附的培养基，烘干，称重，得菌丝体干重，考察无机盐对菌丝生长的影响。

在培养基中，分别加入1 mg/L的VB1、VB2、VB6、VB1+ VB2（等比例）、复合VB，以不添加维生素为对照，连续培养15 d，测定菌丝体生长的直径，然后将菌丝体用蒸馏水清洗干净，洗去表面粘附的培养基，烘干，称重，得菌丝体干重，考察维生素对菌丝生长的影响。

1.2.4黄绿蜜环菌培养条件优化根据单因素实验结果，选取马铃薯为碳源；黄豆芽为氮源；KH2PO4+ MgSO4为无机盐；VB1+VB2（等比例）为生长因子。按正交实验设计，采用正交设计助手设计L9（34）正交表安排实验，见表1，连续培养15 d，将菌丝体表面的培养基用蒸馏水清洗干净，烘干，称重，记录菌丝体干重。

表1　黄绿蜜环菌培养条件优化因素水平表Table 1　Orthogonal factors and levels table of Armillarialuteo-rivens

1.2.5数据处理数据处理采用正交设计助手软件。

2　结果与讨论

2.1菌种分离与纯化

来自不同地方的黄绿蜜环菌，其菌丝体在PDA培养基上生长长势有显著的差异，其中以海北分离到的黄绿蜜环菌菌株（AM-H）的长势最好，黄南（AM-N）和玉树（AM-Y）的次之，果洛分离的菌株（AM-G）最差，结果见表2。

表2　黄绿蜜环菌菌株形态特征Table 2　The morphological characteristics of Armillarialuteo-rivens strain

2.2.1不同碳、氮源对黄绿蜜环菌菌丝生长的影响黄绿蜜环菌菌丝体对碳源的利用以马铃薯最好，其他依次为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖，可溶性淀粉最差。菌丝体对氮源的利用以黄豆芽最好，其他依次为硝酸铵、氯化铵、蛋白胨，硝酸钾最低，结果见图1、图2。

2.2.2无机盐及维生素对黄绿蜜环菌菌丝生长的影响单因素实验结果表明：菌丝体对磷酸二氢钾利用最好，其他依次为硫酸铜、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌。菌丝体对维生素的利用以VB1+VB2（等比例）最好，其次VB1、VB2、复合VB，对VB6的利用最差，结果见图3、图4。

图1　不同碳源对菌丝体生长的影响Fig.1　The impacts of diverse carbon source on mycelium growth

图2　不同氮源对菌丝体生长的影响Fig.2　The impacts of diverse nitrogen source on mycelium growth

图3　无机盐对菌丝体生长的影响Fig.3　The impacts of inorganic salt on mycelium growth

图4　维生素对菌丝体生长的影响Fig.4　The impacts of vitamin on mycelium growth

2.3黄绿蜜环菌培养条件优化结果

由表3可见，对于黄绿蜜环菌菌丝生长的影响，碳源为A1＞A2＞A3、氮源为B1＞B2＞B3、无机盐为C1＞C3＞C2、维生素为D1＞D2＞D3。结果表明：碳源对黄绿蜜环菌菌丝生长的影响最大，其他依次为氮源、维生素、无机盐。黄绿蜜环菌菌丝培养最优化培养条件为A1B1C1D1，即马铃薯浸出液20%、黄豆芽浸提液10%、KH2PO40.3‰、VB1+VB2（等比例）1 mg/L、蒸馏水1000 mL、pH6.5、培养温度25℃。

表3　黄绿蜜环菌菌丝体培养条件正交实验结果Table 3　The results of orthogonal experiment of Armillarialuteo-rivens mycelium

2.4验证实验

在最优培养条件下即：马铃薯浸出液20%、黄豆芽浸提液10%、KH2PO40.3‰、VB1+VB2（等比例）1 mg/L、蒸馏水1000 mL、pH6.5、培养温度25℃，培养黄绿蜜环菌，进行三批工艺验证实验，结果见表4，菌丝体平均收率为6.5 mg/mL。工艺验证实验表明以上工艺为最优化工艺。

表4　验证实验Table 4　The test of process validation

3　结论

本实验在参考以往有关研究的基础上，对黄绿蜜环菌人工培养所需的碳源、氮源、无机盐、维生素、pH及培养温度进行综合研究，通过单因素实验和正交实验得到黄绿蜜环菌菌丝体培养的最优化条件为：马铃薯浸出液20%、黄豆芽浸提液10%、KH2PO40.3‰、VB1+VB2（等比例）1 mg/L。本实验为解决野生黄绿蜜环菌资源量问题提供了理论依据。但是本文以菌落的直径大小和菌丝体干重作为考量菌种生长的指标，而对于菌丝体的化学组成及其品质评价未做探讨。所以，下一步实验有必要对黄绿蜜环菌人工培养的菌丝体与野生黄绿蜜环菌的化学成分、营养价值之间的差异进行深入研究。

［1］刁治民.青海草地黄绿蜜环菌生态学特性及营养价值研究［J］.中国食用菌，1997，16（4）：21-22.

［2］刁治民.黄绿蜜环菌生理特性的初步研究［J］.微生物学杂志，1997，17（1）：14-17.

［3］王启兰，姜文波，陈波.黄绿蜜环菌蘑菇圈生长对土壤及植物群落的影响［J］.生态学杂志，2005，24（3）：269-272.

［4］李世峰，陈桂琛，毕玉蓉.两种野生食用菌抗氧化及抗肿瘤活性研究［J］.中国食用菌，2005，24（3）：58-63.

［5］黄年来.黄绿蜜环菌的分类地位和特征特性［J］.食用菌，1995，12（6）：11.

［6］柳焕章，王贺祥，刘庆红，等.黄绿蜜环菌菌丝体培养条件初探［J］.中国食用菌，2007，26（4）：16-19.

［7］周连玉，朱莉莉，邓旭武，等.黄蘑菇深层发酵条件研究［J］.湖南农业大学学报，2010，36（1）：110-112.

［8］魏永林.野生黄蘑菇人工栽培实验初探［J］.青海气象，2002，（2）：19～24.

［9］李渝珍.青海野生黄绿蜜环菌人工驯化技术途径的探讨［J］.青海师范大学学报，2005（1）：74-76.

Study on the separation and domestication of Armillarialuteo-rivens strain

SHI Qiang-qiang1，2，DANG Jun1，YUAN Xiang1，2，YUE Hui-lan1，WANG Qi-lan1
（1.Northwest Institute of Plateau Biology，CAS，Key Laboratory of Tibetan Medicine Research，CAS，Xining 810008，China；2.University of Chinese Academy of Science，Beijing 100049，China）

With tissue-isolate method，the Armillaria luteo-rivens strain was isolated from the juncture between stipe and pileus of its fruit body.The purified strain was obtained after repeated purification.The strain as experimental material，the colony diameter and mycelia yield were taken as indexes to study the influence of mycelia growth by different carbon source，nitrogen source，inorganic salt，vitamin，and were carried out through the single factor test and orthogonal test.The result showed that the optimal culture condition of Armillarialuteorivens was potato 20%，extract of soybean sprouts 10%，KH2PO40.3‰，VB1+VB21 mg/L（proportion）.Under this culture condition，the mycelia yield was up to 6.5 mg/mL.

Armillaria luteo-rivens；strain separation；artificial domestication

TS201.3

A

1002-0306（2015）20-0180-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.029

2014－12－23

史强强（1989-），男，硕士研究生，研究方向：微生物天然产物化学，E-mail：shiqq89@126.com。

王启兰（1964-），女，副研究员，研究方向：微生物天然产物化学研究，E-mail：wql@nwipb.cas.cn。

青海省高新技术研究与发展计划（2012-G-218）。