响应面法优化盐藻β-胡萝卜素超声波提取工艺

孙协军，李佳伟，李秀霞，毕海燕，薛晓霞

（渤海大学化学化工与食品安全学院，辽宁锦州121013）

响应面法优化盐藻β-胡萝卜素超声波提取工艺

孙协军，李佳伟，李秀霞*，毕海燕，薛晓霞

（渤海大学化学化工与食品安全学院，辽宁锦州121013）

对盐藻β-胡萝卜素超声波辅助提取工艺参数进行了优化研究。结果表明，在所选择的几种溶剂中，无水乙醇的提取效果最好，以β-胡萝卜素得率为衡量指标，各溶剂提取效率的顺序为：无水乙醇＞95%乙醇＞无水乙醇和乙酸乙酯混合溶液（2∶1，v/v）＞石油醚＞三氯甲烷＞乙腈＞乙酸乙酯。通过响应面实验对超声波提取盐藻β-胡萝卜素的工艺进行了优化，得到了相应的数学模型，在所选的各因素水平范围内，各因素相互间均没有交互作用，三个考查因素对盐藻中β-胡萝卜素得率影响的顺序为：超声波功率＞超声时间＞液固比，确定超声波辅助提取β-胡萝卜素的最佳工艺参数为：液固比500mL/g、超声波功率496W、超声时间7min，β-胡萝卜素得率的预测值为1.282%，在优化条件下，β-胡萝卜素得率测定值为1.273%，说明提取模型的适应性良好。

盐藻，β-胡萝卜素，超声波提取，工艺

盐藻，即盐生杜氏藻（Dunaliella Salina），属绿藻门，绿藻纲，团藻目，盐藻科［1］，为绿色单细胞微藻，是迄今为止发现的最耐盐的真核生物之一，可在接近淡水直至饱和盐水的环境中生存和繁殖［2］，盐藻可以在盐碱地、盐湖、粘土地、滩涂以及浅海、湖泊养殖［3］。在我国的内蒙吉兰泰和海南等地，都已经实现了盐藻的养殖和加工的工业化生产。盐藻细胞内有一杯状色素体，色素体内的色素主要是叶绿素和β-胡萝卜素，盐藻在高盐压力和营养限制的条件下，β-胡萝卜素积累量迅速增加，盐藻中累积的β-胡萝卜素含量最高可达藻体干重的14%［4］。人们主要采用植物油或有机溶剂作为萃取剂来提取盐藻中的β-胡萝卜素，盐藻中β-胡萝卜素主要以游离形式存在，但基本不含类胡萝卜素酯，所以，盐藻β-胡萝卜素萃取液可不经皂化处理。溶剂直接萃取盐藻β-胡萝卜素的效率较高，但耗时较长，为提高溶剂萃取的效率，需要外加新技术的辅助，而超临界二氧化碳萃取［5］、超声波［6-7］及微波［8］等辅助提取是近年来常用的类胡萝卜素提取新技术。其中，超声波辅助提取具有耗时短和效率高的特点。采用超声波辅助溶剂萃取进行β-胡萝卜素的提取，借助于超声波的机械效应和空化作用，物料组织细胞被破坏，细胞内容物溶出，提高了溶剂的萃取效率。近年来，超声波辅助萃取技术在植物原料β-胡萝卜素的提取上得到广泛应用［9］，已经具有一定的应用基础，而盐藻中存在着β-胡萝卜素的多种顺式异构体及其他类胡萝卜素物质，采用分光光度法进行定量存在一定的误差。本实验以工业盐藻粉为原料，采用HPLC-DAD方法分离定量，对盐藻粉β-胡萝卜素的超声波辅助提取工艺进行研究，为微藻粉类胡萝卜素提取方面的应用提供技术依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

盐藻粉购自大连丰源达饵料有限公司；β-胡萝卜素标准品（纯度≥98%） 上海源叶生物科技有限公司；甲醇、丙酮色谱级，天津大茂化学试剂厂；其他试剂均为分析纯。

P680型高效液相色谱仪（配DAD检测器） 美国戴安公司；FA2004型电子天平上海恒平科学仪器有限公司；RE-2000型旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂；SCIENTZ-（Ⅱ）D型超声波细胞粉碎仪宁波新芝生物科技股份有限公司；PS02-AD-DI型超纯水机上海讯辉环保科技有限公司；SHZ-D（Ⅲ）型循环水真空泵上海申光仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1不同提取溶剂的影响准确称取盐藻粉0.4000g，置于100mL玻璃烧杯中，向烧杯中分别加入乙酸乙酯、无水乙醇、95%乙醇、无水乙醇/乙酸乙酯混合液（2∶1，v/v）、乙腈、三氯甲烷和石油醚100mL，设定超声波破碎仪功率为300W，探头置于液面下1.5cm处，超声2s/间歇2s，超声90次，即总超声时间3min，总间歇时间3min，提取后的混合液减压抽滤，等体积的提取溶剂洗涤抽滤瓶中滤渣。所得滤液在50℃旋转蒸发掉大部分溶剂后，乙酸乙酯溶解并定容至50mL，0.45μm膜过滤后，HPLC检测其β-胡萝卜素浓度。

1.2.2液相色谱检测条件Develosil C30色谱柱；甲醇：丙酮（30/70，v/v）为流动相；流速1.0mL/min；柱温25℃；检测波长：452nm；进样量：20μL。

1.2.3标准曲线的绘制准确称取β-胡萝卜素标准品4.8mg，丙酮溶解并定容至25mL，配制成β-胡萝卜素浓度为192μg/mL的标准储备液，再分别稀释至β-胡萝卜素浓度为192、153.6、115.2、76.8、38.4和19.2μg/mL的系列标准溶液。此系列标准溶液按1.2.2条件进行检测，以峰面积（mAU）为横坐标，β-胡萝卜素浓度平均值（μg/mL）为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.4β-胡萝卜素得率的计算方法β-胡萝卜素得率（%）=提取液中β-胡萝卜素浓度×定容体积/盐藻粉质量×100

1.2.5提取单因素实验设计液固比的影响：分别称取1.0000、0.5000、0.3333、0.2500、0.2000和0.1667g盐藻粉置于100mL烧杯中，向5个烧杯中各加入100mL无水乙醇，使其液固比分别为100、200、300、400、500和600mL/g，固定超声波破碎仪功率为300W，总超声时间3min（总间歇时间3min，每工作2s间歇2s），进行浸提实验，后继步骤同1.2.1，比较β-胡萝卜素得率。

超声波功率的影响：称取盐藻粉0.2500g 5份，分别置于100mL烧杯中，向5个烧杯中各加入100mL无水乙醇，使其液固比为400mL/g，选取超声波功率分别为200、300、400、500和600W，总超声时间3min（总间歇时间3min，每工作2s间歇2s），进行浸提实验，后继步骤同1.2.1，比较β-胡萝卜素得率。

超声时间的影响：称取盐藻粉0.4000g 5份，分别置于100mL烧杯中，向5个烧杯中各加入100mL无水乙醇，使其液固比为250mL/g，选取超声波功率为300W，分别提取1、2、4、6、8和10min（超声2s/间歇2s），后继步骤同1.2.1，比较β-胡萝卜素得率。

1.2.6响应面实验设计为进一步确定超声波辅助提取条件和各因素的影响顺序，依据design-expert 7.0进行响应面实验设计，以β-胡萝卜素得率为考察指标，以液固比（X1）、超声波功率（X2）和超声时间（X3）为自变量，共设立20个处理组，具体实验设计见表1。

表1　盐藻β-胡萝卜素超声波提取响应面实验设计Table 1　Response surface experiment design of ultrahigh pressure extraction of β-carotene from Dunaliella salina

1.3数据处理

实验数据采用Excel和SPSS17.0软件进行分析，以全反式β-胡萝卜素得率为考察指标。

2　结果与分析

2.1HPLC分离结果和标准曲线的建立

β-胡萝卜素标准溶液及盐藻提取液的液相色谱图如图1和图2所示。参考前人的研究成果［4］，采用保留时间和DAD光谱扫描图（见图1和图2）方法对图2提取液中全反式β-胡萝卜素定性，确认保留时间15.142min色谱峰为全反式β-胡萝卜素，其最大吸收波长为451.9nm，与图1中反式β-胡萝卜素标准品色谱峰的最大吸收波长（见图1，452.4nm）相近，而保留时间12.975的色谱峰则为α-胡萝卜素或β-胡萝卜素的其他类似物［10］。在图2中，保留时间为12.975的色谱峰前出峰的物质含量均较低，没有得到质量较好的光谱扫描图，无法确认其来源。从图2可以看出，盐藻提取液中的反式β-胡萝卜素色谱峰与其他色谱峰分离度较高。所得标准曲线的回归方程为：Y=0.3815X-0.7905，R2=0.9991，其中Y为浓度（μg/mL），X为峰面积（mAU），回归方程的线性范围为19.2～192μg/mL，按3倍信噪比（N/S）计算，反式β-胡萝卜素（以下简称β-胡萝卜素）最低检出限为0.5μg/mL。

图1　β-胡萝卜素标准溶液色谱图Fig.1　Chromatogram of β-carotene standard

图2　盐藻β-胡萝卜素提取液色谱图Fig.2　Chromatogram of β-carotene carotene from D.salina

2.2盐藻β-胡萝卜素提取的单因素实验结果

2.2.1不同提取溶剂对盐藻β-胡萝卜素得率的影响选择适合的溶剂是提高提取效率的重要条件，在常用的溶剂中，对β-胡萝卜素溶解度的高低顺序为：四氢呋喃＞乙醚＞正己烷＞乙酸乙酯＞丙酮＞乙醇＞乙腈＞甲醇［10-11］，在本实验中，根据盐藻粉的物料性质和β-胡萝卜素在不同溶剂中的溶解度差异选择了以乙醇和乙酸乙酯为代表的几种溶剂进行了提取实验，不同溶剂作为提取剂的实验结果如图3所示。各溶剂提取β-胡萝卜素得率高低顺序为：无水乙醇＞95%乙醇＞乙醇/乙酸乙酯（2∶1，v/v）混合溶液＞石油醚＞三氯甲烷＞乙腈＞乙酸乙酯，无水乙醇的提取效率明显高于其他溶剂（p＜0.05），这与常规提取方法中提取β-胡萝卜素的最佳提取溶剂不同［12］，但与本实验室中以超高压技术提取盐藻β-胡萝卜素的溶剂选择结果一致。与四氢呋喃和乙醚等溶剂相比，无水乙醇的极性相对较高，盐藻粉在极性较高的溶剂中的分散性很好，却很难浸润在石油醚等溶剂中，通常是成团散布在溶剂表面。与含水的乙醇溶液及甲醇等极性更高的溶液相比，β-胡萝卜素在无水乙醇中的溶解性更好。因此选择无水乙醇为盐藻β-胡萝卜素的提取溶剂，进行以下实验。

2.2.2液固比的影响在以无水乙醇为提取溶剂，超声波功率为300W，超声时间3min的条件下，液固比对盐藻β-胡萝卜素得率的影响结果见图4。由图4可见，在液固比从100mL/g增加到400mL/g时，β-胡萝卜素得率从0.323%增加到0.823%，提高幅度较大。当液固比高于400mL/g时，随着液固比的增加，β-胡萝卜素得率逐渐下降；在液固比为600mL/g时，盐藻β-胡萝卜素得率降为0.746%。本实验所用超声波破碎仪要求料液高度在3cm以上，需要较多的提取溶剂，因此，本实验在液固比水平的设置上，同采用超声波清洗器所做实验有较大差异［6］。而且，由于本实验用盐藻粉β-胡萝卜素含量较高（1%左右），而β-胡萝卜素在乙醇等溶剂中溶解度较低，在1.00～4.00g/100g溶剂左右［10］，较高的液固比有助于提高β-胡萝卜素的溶出，提高其提取效率，也有利于减压抽滤操作的进行。但较高的液固比增加了后继旋转蒸发步骤的操作时间，导致β-胡萝卜素提取液在旋蒸水浴中停留时间增长，引起β-胡萝卜素一定量的损失，从实验结果看，选择400mL/g的液固比进行以下实验较为合适。

图3　不同溶剂对盐藻β-胡萝卜素得率的影响Fig.3　Effect of different solvent on β-carotene yield of D.Salina

图4　液固比对盐藻β-胡萝卜素得率的影响Fig.4　Effect of liquid to solid ratio on β-carotene yield of D.Salina

2.2.3超声波功率的影响超声波功率在达到200W后对类胡萝卜素的提取产生有效的强化作用［13-14］。因此，本实验将超声波功率设定在200～600W之间。超声波功率对盐藻β-胡萝卜素得率的影响结果见图5，从图5中可以看出，在超声波功率由200W增加到400W时，β-胡萝卜素得率由0.444%提高到0.956%。这是由于在超声波的空化作用下，盐藻细胞膜结构被破坏，β-胡萝卜素溶出，而超声波功率的提高则有助于有效成分的溶出更加迅速完全，提高了β-胡萝卜素的得率［13］。当超声波功率超过400W后，β-胡萝卜素的得率呈现逐渐下降的趋势，在超声波功率升高为600W时，β-胡萝卜素的得率降为0.879%；此时，超声波所引起的机械摩擦作用已经引起提取溶剂温度明显的上升，β-胡萝卜素是对热敏感的一类色素，而超声波功率越高，机械作用越明显，因此，选择400W为适合的超声波功率进行下一步实验。

图5　超声波功率对盐藻β-胡萝卜素得率的影响Fig.5　Effect of ultrasound power on β-carotene yield of D.Salina

2.2.4超声时间的影响超声时间对盐藻β-胡萝卜素得率的影响结果见图6所示，由图6可知，超声时间对盐藻β-胡萝卜素得率的影响规律与常规提取方法类似［12］。在液固比为400mL/g和超声波功率为400W的条件下，随着超声波破碎仪工作时间的增加，β-胡萝卜素在6min内的得率逐渐增加，在6min时达到1.157%；在6min以后，随着超声时间增加，β-胡萝卜素得率逐渐下降，在10min时降为0.856%。由于盐藻细胞通常为十几微米左右，提取溶剂在较短时间内即可以渗透到细胞内部，使得β-胡萝卜素的溶解扩散迅速达到平衡，因此β-胡萝卜素的最佳提取时间较短。而在提取达到溶解扩散平衡以后，较长的超声时间对β-胡萝卜素稳定性影响的效果加大，因此，选择超声时间为6min进行响应面实验。

图6　超声时间对盐藻β-胡萝卜素得率的影响Fig.6　Effect of extracting time on β-carotene yield of D.Salina

2.3盐藻β-胡萝卜素提取响应面实验结果及分析

通过单因素实验，选取液固比（X1）、超声波功率（X2）和超声时间（X3）进行三因素三水平的响应面实验，实验设计的因素、水平和实验结果见表2。用Design-expert 7.0软件对实验数据进行多元回归拟合，得到盐藻中β-胡萝卜素得率的回归方程如下：

Y=1.245-0.021X1+0.065X2+0.057X3+0.012X1X2+ 0.011X1X3-0.009X2X3-0.042X12-0.033X22-0.002X32

表2　响应面实验结果及分析Table 2　Experimental results and analysis of the response surface

表3 方差分析结果Table 3　Analysis of variance results

方差分析结果见表3，由表3可以看出，模型极显著（p＜0.01），而失拟项不显著（p＞0.05），模型的相关系数R2为89%，说明模型拟合程度较好，实验误差较小，该模型是合适的，可以用该模型方程来分析和预测不同超声波辅助提取条件下盐藻β-胡萝卜素得率的变化。在所选的各因素水平范围内，各因素相互间交互作用影响均不显著（p＞0.05），三个考察因素对盐藻中β-胡萝卜素得率影响的顺序为：超声波功率＞超声时间＞液固比。

通过design expert7.0软件拟合，得出超声波辅助提取β-胡萝卜素的最佳工艺参数为：液固比500mL/g，超声波功率496W，超声时间7min，β-胡萝卜素得率预测值为1.282%。在此优化条件下，采用超声波辅助提取盐藻β-胡萝卜素，提取实验重复3次，β-胡萝卜素得率实测值为1.273%，与预测值的相对误差为0.7%，与预测结果基本相符。

3　结论

3.1在本研究选取的六种溶剂中，无水乙醇提取效果最好。在所选的各因素水平范围内，各因素相互间交互作用影响不显著，三个考察因素对盐藻中β-胡萝卜素得率影响的顺序为：超声波功率＞超声时间＞液固比。

3.2建立了超声波辅助提取盐藻β-胡萝卜素的数学模型，确定超声波辅助提取β-胡萝卜素的最佳工艺参数为：液固比500mL/g，超声波功率496W，超声时间7min，在优化条件下，盐藻β-胡萝卜素得率为1.273%。

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Optimization of extracting technique assisted by ultrasound assisted extraction of β-carotene from Dunaliella salina by response surface methodology

SUN Xie-jun，LI Jia-wei，LI Xiu-xia*，BI Hai-yan，XUE Xiao-xia
（College of Chemistry，Chemical Engineering and Food Safety，Engineering and Technology Research Center of Food Preservation，Processing and Safety Control of Liaoning Province，Jinzhou 121013，China）

Extracting technique assisted by ultrasound assisted extraction method of β-carotene from D.Salina was optimized.The result showed that absolute ethanol was the optimal solvent among these kinds of solvent selected，the β-carotene yield of D.Salina was used as measurement index，the sequence of extraction efficiency of different solvent was that absolute ethanol＞95%ethanol＞absolute ethanol/acetic ether（2∶1，v/v）＞petroleum＞chloroform＞acetonitrile＞acetic ether.The mathematical model of ultrasound assisted D.Salina β-carotene extraction was established by response surface methodology，within the scope of each factor levels，there was no interaction between different factors.The sequence of the effect of three factors on β-carotene yield was that ultrasonic power＞ultrasonic time＞ratio of liquid to solid.The optimal condition for extraction technique was that L/S 500mL/g，ultrasonic power 496W，ultrasonic time 7min，under the optimal condition，the predicted β-carotene yield was 1.282%，and the measured value was 1.273%，it was described that the adaptable of model was good. Key words：D.Salina.；β-carotene；ultrasound assisted extraction；technology

TS201.1

B

1002-0306（2015）12-0278-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.049

2014－07－21

孙协军（1969-），男，大学本科，实验师，研究方向：食品资源开发利用。

李秀霞（1973-），女，博士，副教授，研究方向：水产品贮藏加工。

“十二五”国家科技支撑计划（2012BAD29B06）；辽宁省食品安全重点实验室开放课题（LNSAKF2011015）。