超声波辅助提取川明参挥发油及化学成分的GC-MS分析

董红敏，李　路，沈丽雯，李慧妍，李　玉，秦　文

（四川农业大学食品学院，四川雅安625014）

超声波辅助提取川明参挥发油及化学成分的GC-MS分析

董红敏，李路，沈丽雯，李慧妍，李玉，秦文*

（四川农业大学食品学院，四川雅安625014）

为研究川明参提取工艺及化学成分，在单因素实验基础上，利用Box-Behnken设计原理和响应面分析方法，确定超声波辅助提取川明参挥发油的最优工艺，并利用GC-MS技术对川明参的挥发油成分进行鉴定。结果表明：川明参挥发油超声辅助提取的最佳工艺条件为：液料比8∶1（mL/g）、超声功率175W、超声时间28min。在此工艺条件下得率为2.213%±0.042%。在川明参挥发油中共检测出76种成分，鉴定并确定出其中42种化合物，被鉴定物质相对含量占挥发油总量的97.37%。本方法可为川明参的进一步开发和利用提供参考。

川明参，挥发油，超声波，GC-MS

川明参为伞形科（Umbelliferae）植物川明参属Chuanminshen violaceum Sheh et Shan的根，是我国特有的单种属植物，是四川产道地药材。具有润肺化痰、和胃、健脾、解毒等功效，多用于病后补虚和强壮身体，为一药食同源植物［1-2］。在产地常作为滋补品、菜肴等食用，故具有相当高的药用和食用价值。但从目前的研究报道来看，对川明参的开发利用程度相对较低，主要集中在多糖、蛋白及黄酮等方面［3-4］。有关川明参挥发油化学成分的研究较少。

挥发油常用的提取方法有水蒸气蒸馏法、热回流提取法、超临界CO2流体萃取法等。水蒸气蒸馏法和热回流提取法提取时间长，提取率低；超临界CO2流体萃取法虽然具有提取时间短，溶剂无残留等优点，但操作成本高。超声波辅助提取作为一种优良的提取方法，具有操作简便、提取时间短、提取率高及成本低等特点，广泛应用在生物活性物质的提取方面［5-7］。运用超声波辅助提取川明参挥发油的工艺及其成分分析尚未见报道，本实验在单因素实验基础上运用响应曲面分析法研究超声波辅助提取川明参挥发油的最佳工艺参数，同时通过气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术对挥发油成分进行分析，以期为川明参食用和药用价值的开发利用提供一定的科学依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

新鲜川明参2013年春由四川阆中供销社提供；C7～C30正构烷烃对照品美国Sigma公司；正己烷、石油醚（60～90℃）、乙醚、乙酸乙酯和无水Na2SO4均为分析纯。

FW177中药粉碎机天津市泰斯特仪器有限公司；KQ-250DB型数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；RE-52AA型旋转蒸发器、SHZ-III循环水真空泵上海亚荣生化仪器厂；101-4型恒温鼓风干燥箱上海一恒科学仪器有限公司；7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪美国Agilent公司；电子天平北京赛多利斯仪器系统有限公司。

1.2实验方法

1.2.1川明参挥发油的提取及得油率将新鲜川明参于40℃鼓风干燥箱中烘至恒重。用FW177中药粉碎机粉碎，并过80目筛。放置干燥环境中保存备用。取10g川明参粉于具塞三角瓶中，加入一定液料比（mL/g）的提取剂，在一定超声波辅助提取条件下提取一定时间后，在提取液加入无水Na2SO4后过滤，滤液加入圆底烧瓶中真空回收溶剂后称量。得油率计算公式如下：

式中，m为所取川明参粉质量，g；m1为圆底烧瓶质量，g；m2回收溶剂后圆底烧瓶质量。

1.2.2单因素实验

1.2.2.1提取剂的选择分别以正己烷、石油醚、乙醚、乙酸乙酯为提取剂，固定超声功率100W、超声时间20min、液料比为（mL/g）10∶1，按1.2.1节操作进行提取，每组重复3次，计算得油率，考察提取剂种类对川明参挥发油得油率的影响。

1.2.2.2液料比以1.2.2.1的结果为提取剂，固定超声功率100W、超声时间20min，设置液料比为4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1（mL/g），5个水平，每个水平重复3次，计算得油率，考察不同液料比对川明参挥发油得油率的影响。

1.2.2.3超声功率固定超声时间20min，液料比采用1.2.4.2节选出的结果，超声功率设置为100、125、150、175、200W 5个水平，每个水平重复3次，计算得油率，考察不同超声功率对川明参挥发油得油率的影响。

1.2.2.4超声时间采用以上选出的结果为固定条件，超声时间设置为10、20、30、40、50min 5个水平，每个水平重复3次，计算得油率，考察不同超声时间对川明参挥发油得油率的影响。

1.2.3响应面设计优化川明参挥发油提取工艺在单因素实验基础上，按照Box-Behnken设计原理，选择液料比、超声功率和超声时间为自变量，以挥发油得油率为响应值，利用Design-Expert 8.0.5b软件进行响应曲面分析优化提取条件，响应曲面因素与水平表见表1。

表1　响应面分析因素与水平表Table 1　Factors and levels of response surface analysis

1.2.4GC-MS分析气相色谱条件：HP-5MS毛细管色谱柱（30m×0.32mm，0.20μm）；进样口温度250℃；升温程序为初始温度45℃保持1min，15℃/min升温至90℃，10℃/min升温至200℃，5℃/min升温至290℃、保持3min。载气He，流量为1.2mL/min，溶剂延迟时间：3min；进样量为1μL。

质谱条件：EI离子源，离子源温度230℃，电子能量70eV，质量扫描范围30～500amu，接口温度280℃。

1.2.5保留指数的计算取正构烷烃混合对照品C7～C30，按1.2.4项下条件分析，记录各正构烷烃的保留时间，采用线性升温公式［8］计算各成分的保留指数RIx，RIx=100n+100×（tx-tn）/（tn+1-tn），其中tx，tn，tn+1分别为被分析组分及n和n+1个碳原子数的正构烷烃的流出峰的保留时间（tn＜tx＜tn+1）。

1.2.6化学成分分析定性分析：采用气相色谱-质谱联用仪进行分析鉴定。通过NIST11.L谱库自动检索获得初步鉴定结果，再结合保留指数，选择质谱图和RI值匹配度最高的化学结构为最佳鉴定结果。

定量分析：通过GC-MS数据处理系统，按照峰面积归一法进行定量分析，求出挥发油中各化学成分的相对质量分数。

1.3数据处理

单因素实验数据采用Origin 8.0作图软件作图。响应面实验数据采用Box-Behnken的中心组合实验设计，分析和作图软件使用Design-Expert 8.0.5b软件。所有实验均重复3次。

图1　提取剂种类对川明参挥发油得油率的影响Fig.1　Effect of different solvents on the extraction yield of volatile oil

2　结果与分析

2.1单因素实验

2.1.1提取剂种类对川明参挥发油得油率的影响不同提取剂对川明参挥发油得油率影响结果如图1所示。除乙酸乙酯提取物为深褐色浑浊黏稠状，其他3种溶剂提取物为黄色透明、有芳香气味的油状物并含有少量白色结晶蜡状固体。这可能是因为乙酸乙酯极性相对较高，提取物含极性高、难挥发性物质较多。4种溶剂中得油率最高的为石油醚（60～90℃）且价格也比正己烷低，故选用石油醚（60～90℃）作为提取剂。

2.1.2液料比对川明参挥发油得油率的影响不同液料比对川明参挥发油得油率的影响结果如图2所示，液料比在4∶1～8∶1之间时，得油率随提取剂用量的增加而迅速提高，这是因为随着液料比的增加，增加了固相与液相间的浓度差，有利于挥发油成分的溶出，液料比超过8∶1后，得油率变化不大，略有下降。这可能是因为液料比增加会使超声波空化作用相对减弱，从而使得油率下降。因此液料比以8∶1为宜。

图2　液料比对川明参挥发油得油率的影响Fig.2　Effect of liquid to solid ratio on the extraction yield of volatile oil

2.1.3超声功率对川明参挥发油得油率的影响不同超声功率对川明参挥发油得油率的影响结果如图3所示，随着超声功率的增加，超声波对细胞壁的破碎作用增强，挥发油溶出速率增大，得油率逐渐增加，功率超过175W时，得油率略有下降。相似的结果在超声提取木薯皮香豆素时也有出现过［9］，可能是因为超声功率大于175W时，提取液振动加速，产生的空化作用使空化气泡闭合过快，细胞破碎作用随之减弱，导致得油率下降。因此超声功率以175W为宜。

图3　超声功率对川明参挥发油得油率的影响Fig.3　Effect of ultrasonic power on the extraction yield of volatile oil

2.1.4超声时间对川明参挥发油得油率的影响不同超声时间对川明参挥发油得油率的影响结果如图4所示，在10～30min时，得油率随着超声时间的增加而迅速提高，随后提取率有所下降。其原因可能是随着时间的增加，在超声波作用下川明参细胞破碎度逐渐增大，挥发油溶出量逐渐增加，得油率提高；但继续延长超声时间，川明参细胞碎片过多阻碍挥发油溶出［10］，得油率下降。

图4　超声时间对川明参挥发油得油率的影响Fig.4　Effect of ultrasonic time on the extraction yield of volatile oil

2.2响应面优化超声波提取工艺

2.2.1响应曲面实验设计与结果在单因素实验的基础上，以川明参挥发油得油率为实验指标，用Design-Expert 8.0.5b软件设计响应面实验方案，以液料比（X1），超声功率（X2）与超声时间（X3）作为响应面实验的因素，进行三因素三水平17个实验点的响应面分析实验，响应面实验设计及结果见表2。

表2　响应面实验设计及结果Table 2　Experimental design and results of response surface analysis

运用Design Expert 8.0.5b数据统计分析软件对表2实验结果进行多元回归拟合，得川明参挥发油得油率与各因素的二次多项式回归模型为：

Y=2.1736-0.05788X1+0.20175X2-0.06038X3+ 0.038X1X2-0.03525X1X3+0.1265X2X3-0.43493X12-0.46818X22-0.07993X32

对该回归模型进行方差分析，结果见表3，回归系数显著性检验结果见表4，响应曲面图见图5。

表3　回归模型方差分析Table 3　Analysis of variance for the fitted regression model

从表3可以看出，该模型p＜0.0001，表明该二次回归方程模型极显著，模型的相关系数R2=0.994733，表明该模型可以解释99.47%的响应值Y的变化，模型修正R2（0.98796）与预测R2（0.930725）相差不大，表明模型实际值与预测值拟合较好，且失拟项p= 0.0680＞0.05，失拟项不显著，实验误差较小，因此可用该模型对川明参挥发油的超声提取效果进行分析和预测。

表4　回归系数的显著性检验Table 4　Significance test of each regression coefficient

由表4可知，模型一次项和二次项对响应值Y影响都极显著（p＜0.01），说明分析结果可靠；模型交互项X2X3对响应值Y影响极显著，表明各影响因素对得油率的影响非简单的线性关系；从实验所得的响应面分析结果可以找到提取过程中的交互作用，如表4和图5可知，超声功率和超声时间的交互作用极显著，其余项之间的交互作用不明显。根据F值大小，可知各因素对得油率影响的程度依次是超声功率（X2）＞超声时间（X3）＞液料比（X1）。

2.2.2验证实验运用Design Expert 8.0.5b软件对实验结果进行优化分析，确定最佳提取条件为：液料比7.9∶1、超声功率179.58W、超声时间27.79min，在该超声条件下，预测得油率可达到2.200%。考虑到实际操作的可行性，将最佳工艺条件修正为：液料比8∶1、超声功率175W、超声时间28min。采用上述优化条件进行3次验证实验，得油率实测值为2.213%±0.042%，表明实测值与预测值基本吻合，该模型能较好的预测川明参总挥发油得油率，可用于指导生产实践。

图5　各两因素交互作用对得油率的影响Fig.5　Response surface plots of mutual influences of extraction conditions on the extraction yield of volatile oil

图　川明参挥发油的TICFig.6　The TIC of the volatile oil from Chuanminshen violaceum

2.3川明参挥发油的GC-MS分析

对川明参挥发油进行气相色谱-质谱联用分析，总离子流图（TIC）见图6、鉴定结果见表5。采用面积归一化法从川明参挥发油中共检测出76种成分，鉴定并确定出其中42种化合物，占其总量的97.37%，其中酸类3种，占挥发油的36.09%，醇类1种，占挥发油的18.88%，酯类10种，占挥发油的15.64%，酮类6种，占挥发油的13.62%，烃类18种，占挥发油的11.18%，酚类1种，占挥发油的0.8%，醛类1种，占挥发油的0.31%，其他化合物2种，占挥发油的0.85%。相对含量较高的有镰叶芹醇（18.88%）、亚油酸（26.13%）、棕榈酸（9.8%）、亚磷酸二（十二烷基）酯（6.4%）、3，4-双氢-8-羟基-6-甲氧基-3-甲基-苯并吡喃酮（5.2%）、欧前胡素（3.87%）等成分。

表5　川明参挥发油的化学成分Table 5　Chemical compositions of volatile oil from Chuanminshen violaceum

一些化合物的质谱极相似，所得匹配度高的化合物不止一种。仅靠质谱图的匹配，难以对化合物准确定性，采用保留指数辅助定性可以提高川明参挥发油化学成分的准确性。相同实验条件下，测定C7～C30系列正构烷烃标准溶液的TIC谱图见图7。计算本实验条件下待鉴定化合物的保留指数，见表5，与质谱匹配度高的几种化合物的参考保留指数进行比对，将偏差较大的化合物排除，选择保留指数较为一致的（偏差不超过3%）［11］。为化合物的准确定性提供依据。

图7　C7～C30系列正构烷烃标准溶液的TICFig.7　The TIC of standard solution of C7～C30

所得化合物中亚油酸是不饱和脂肪酸，具有预防癌症、心血管疾病、糖尿病以及免疫调节等作用［12-13］；棕榈酸是机体，特别是婴儿生长最重要的脂肪酸，为机体的生长发育、大脑活动、新陈代谢提供能量，是机体代谢不可缺少的饱和脂肪酸［14］；镰叶芹醇又称人参炔醇，具有抗癌、降压、抗菌等生物活性［15］；欧前胡素等香豆素成分具有抗菌、平喘及抗过敏等作用［16-17］。此外，川明参挥发油具有独特的香味，这可能与其含有大量酯类和香豆素类化合物有关。

3　结论

3.1在单因素实验的基础之上，采用Box-Behnken实验设计以及响应面分析对提取工艺进行优化，得出最优工艺条件为：液料比8∶1、超声功率175W、超声时间28min。在此工艺条件下得油率为2.213%± 0.042%。该方法操作简单方便，成本低，为川明参挥发油的工业化生产提供科学依据和参考。

3.2采用保留指数对川明参挥发油各组分进行鉴别，为明确各组分出峰顺序及进一步研究川明参挥发油组分提供了依据。从上述鉴定的结果可以看出，川明参挥发油中的主要成分是酸类、醇类、烃类、酯类、醛类、酮类及酚类。所得川明参挥发油组分以保留指数大，高沸点组分为主，表明超声波辅助提取法适用于高沸点组分的提取。目前未有报道单一提取方法可全面提取植物挥发油组分，各提取方法都只能获得部分挥发性成分，为全面分析川明参挥发油组分，应进一步考虑多种方法综合使用。

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Ultrasonic-assisted extraction and composition analysis by Gas Chromatography-Mass Spectrometry of volatile oil from Chuanminshen violaceum

DONG Hong-min，LI Lu，SHEN Li-wen，LI Hui-yan，LI Yu，QIN Wen*
（College of Food Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China）

To study the extraction and analysis of chemical constituents in volatile oil from Chuanminshen violaceum，the volatile oil of from Chuanminshen violaceum was extracted by ultrasonic-assisted extraction method and its chemical composition was analyzed by GC-MS.On the basis of single factor experiments，a polynomial regression model was fitted by means of Box-Behnken design.The optimum extraction conditions were as follows：liquid to solid ratio 8∶1（mL/g），ultrasonic power 175W，and ultrasonic time 28min.Under the conditions，the extraction yield of volatile oil reached 2.213%±0.042%.A total of 76 compounds were detected in the volatile oil，of which 42 were identified，accounting for 97.37%of the total volatile compounds.This study could provide useful

for the development and exploitation of Chuanminshen violaceum.

Chuanminshen violaceum；volatile oil；ultrasonic；GC-MS

TS201.1

B

1002-0306（2015）12-0259-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.046

2014－09－25

董红敏（1989-），女，硕士研究生，研究方向：农产品产后处理与品质控制。

秦文（1967-），女，博士，教授，研究方向：农产品产后处理与品质控制。