信阳毛尖茶色素的超声提取及其抗氧化活性

李　斌，武晓雪，孟瑶瑶，王丽波（南阳理工学院，生物与化学工程学院，河南南阳473004）

信阳毛尖茶色素的超声提取及其抗氧化活性

李斌，武晓雪，孟瑶瑶，王丽波
（南阳理工学院，生物与化学工程学院，河南南阳473004）

目的：优化信阳毛尖茶色素的超声提取工艺及研究其抗氧化活性。方法：在单因素实验的基础上采用正交实验法，考察了料液比、超声温度、超声时间和提取次数对得率的影响；通过二苯基苦基苯肼（DPPH）自由基、超氧自由基以及羟自由基的清除实验评价信阳毛尖茶色素的抗氧化活性。结果：所考察因素中，对信阳毛尖茶色素得率的影响程度是料液比＞提取次数＞超声温度＞超声时间。超声提取的最佳条件是料液比1∶30、超声温度80℃、超声时间120 min、提取次数3次，该条件下茶色素得率达到了33.1%。信阳毛尖茶色素具有清除体外自由基的活性，其活性在一定浓度范围内随着浓度的增大而增强，对羟基自由基清除活性尤为明显。结论：采用正交实验优化提取条件，明显提高了信阳毛尖茶色素的得率；信阳毛尖茶色素具有良好的抗氧化作用，可作为天然抗氧化剂进一步开发和利用。

信阳毛尖，茶色素，提取，抗氧化活性

色素是现代食品工业中不可缺少的食品添加剂之一。人工合成的食用色素化学性质稳定，色泽鲜艳，着色力强，价格低廉，被广泛应用在食品行业中。但是它们本身没有任何营养价值，有的具有慢性毒性，甚至有致癌性，所以人们开始寻找新的天然色素资源［1］。茶叶作为我国消费的主流健康饮料，开始受到世界各国人们的青睐。现代科学研究揭示，茶叶中含有丰富的生物活性物质，它们具有抗氧化［2-3］、清除自由基［4］、抗突变［5］、抗骨质疏松［6］、抗衰老［7-8］、抗癌［5］、抗心血管疾病［9-10］等药理功效。因此，开展茶叶深加工成为世界茶叶加工的趋势所在。我国盛产茶叶，每年从茶园到加工成茶叶产品的一系列生产环节中产生的茶叶副产品数量相当大，将这些副产品及低档茶用于茶叶功能成分的提取，不仅可以合理开发利用自然资源，提高茶叶本身的经济价值，还可以获得一系列茶色素，拓宽色素市场，满足人们日益增长的对天然色素的需求。

信阳毛尖属未发酵的绿茶，产于河南省信阳市的8个县、区，是我国十大名茶之一。其品质优异，外形条索细、圆、紧、直，色泽翠绿，内质汤色碧绿明亮，香气高鲜，滋味鲜浓、爽口，叶底嫩绿且匀整［11］。目前，人们对于信阳毛尖茶多酚［12］、茶多糖［13］、咖啡因［14］等的提取工艺研究都已有报道，但是还未见有人从事茶色素方面的研究。本实验对信阳毛尖茶色素提取进行了单因素分析，并进一步对提取条件进行了正交优化，同时研究了信阳毛尖茶色素的抗氧化作用，旨在为深入研究信阳毛尖茶色素提供一定参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

信阳毛尖信阳市浉河区天潭茶叶有限公司；二苯基苦基苯肼（DPPH）、还原性辅酶I（NADH）、氯化硝基四氮唑蓝（NBT）、吩嗪硫酸甲酯（PMS）、抗坏血酸（VC） 美国Sigma公司；95%乙醇、1，10-菲咯啉、过氧化氢（H2O2）天津市致远化学试剂有限公司；氯仿天津市华东试剂厂；NaOH天津市化学试剂六厂三分厂；HCl开封开化有限公司试剂厂，以上试剂均为分析纯。

U-1800紫外-可见分光光度计日本Hitachi公司；UP3200H超声波清洗器熊猫集团南京电子计量有限公司；JA1003型电子天平上海良平器仪器表有限公司；101-2A型电热鼓风干燥箱天津市泰斯特仪器有限公司；85-1型离心机 上海安亭科学仪器厂；RE-2010型旋转蒸发仪巩义市华予华仪器有限公司；PHS-3C型数显pH计上海雷磁仪器厂；XH-KG66型水平恒温振荡器广东佛山市航星自动化设备有限公司。

1.2实验方法

1.2.1工艺流程本工艺流程参考陈丽如等［15］提出的方法。将茶叶用研钵研磨粉碎，过40目筛，备用。称取一定量茶叶粉末装于250 mL锥形瓶中，按照一定的料液比加入蒸馏水，在一定温度下超声提取，提取完毕后将提取物于5000 r/min离心20 min，取上清液得到茶色素粗溶液。将滤液在50℃减压浓缩至15 mL，加入45 mL 95%乙醇沉淀除去多糖、蛋白质等杂质，并用1 mol/L的HCl调节溶液pH为3.2，静置30 min，5000 r/min离心20 min，取上清液抽滤得滤液。将滤液加入200 g/L NaOH调节pH为7.5，抽滤得滤液。将滤液50℃旋转蒸发至干，60℃真空干燥。所得结晶用氯仿萃取除去生物碱和叶绿素，60℃真空，得精制的茶色素。

1.2.2单因素实验

1.2.2.1料液比对茶色素得率的影响茶色素提取温度60℃下振荡60 min，以1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（mL/g）料液比对茶色素得率做单因素实验。

1.2.2.2超声时间对茶色素得率的影响茶色素提取的料液比为1∶30，温度60℃，以30、60、90、120、150 min超声时间对茶色素得率做单因素实验。

1.2.2.3超声温度对茶色素得率的影响固定茶色素提取的料液比为1∶30，超声60 min，以超声温度30、45、60、75、90、105、120℃对茶色素得率做单因素实验。

1.2.2.4提取次数对茶色素得率的影响茶色素提取的料液比为1∶30，温度60℃，超声60 min，按照工艺流程分别提取1、2、3次。

1.2.3正交实验根据单因素实验结果，以影响茶色素得率的料液比、超声温度、超声时间和提取次数为因素，各取3个水平进行正交实验。采用L9（34）正交表进行正交实验（正交实验的因素和水平见表1），并以茶色素得率作为评价指标，计算得到最优工艺条件，并在该条件下重复3次实验。

表1　正交实验的因素与水平表Table 1　The factors and levels of orthogonal test

1.2.4DPPH自由基清除活性的测定DPPH清除活性的测定参照Duan等［16］的方法并稍做修改。取100 μL不同浓度的信阳毛尖茶色素（20～100 μg/mL），加入2900 μL的120 μmol/L DPPH溶液，混合物在避光条件下37℃反应30 min后，分光光度计测定517 nm处的吸光度值；同时，使用VC作为阳性对照按上述方法测定DPPH清除活性。DPPH的清除活性主要采用下面的公式进行计算：

其中，Ablank是对照实验的吸光度值（即以水代替样品），Asample是样品实验的吸光度值。

1.2.5超氧自由基清除活性的测定超氧自由基清除活性的测定参照Liu等［17］的方法并稍做修改。取1 mL不同浓度的信阳毛尖茶色素（20～100 μg/mL），先后加入由0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）配制的156 μmol/L的NADH，52 μmol/L的NBT和20 μmol/L的PMS溶液各1 mL，混合物在25℃反应5 min后，分光光度计测定560 nm处的吸光度值；同时，使用VC作为阳性对照按上述方法测定超氧自由基清除活性。超氧自由基的清除活性主要采用下面的公式进行计算：

其中，Ablank是对照实验的吸光度值（即以水代替样品），Asample是样品实验的吸光度值。

1.2.6羟基自由基清除活性的测定羟基自由基清除活性的测定参照Jin等［18］的方法并稍做修改。取1 mL不同浓度的信阳毛尖茶色素（20～100 μg/mL），先后加入1 mL的1，10-菲咯啉、1.5 mL的0.15 mol/L的磷酸盐缓冲液（pH7.4）、1 mL的0.75 mmol/L的FeSO4和1 mL的H2O2溶液（0.01%，v/v），混合物在37℃反应30 min后，分光光度计测定536 nm处的吸光度值；同时，使用VC作为阳性对照按上述方法测定羟基自由基清除活性。羟基自由基的清除活性主要采用下面的公式进行计算：

其中，Ablank是对照实验的吸光度值（即以水代替样品），Asample是样品实验的吸光度值，A0是以水替代反应体系中的H2O2和样品的吸光度值。

1.2.7数据分析所有实验重复3次，结果以±SD表示，数据分析采用SAS 9.2软件。

2　结果与分析

2.1单因素实验

2.1.1料液比对茶色素得率的影响料液比是影响茶色素得率的重要因素之一，料液比对茶色素得率的影响如图1所示。由图1可以看出，随着溶液量的增加，茶色素的得率先增大后减少，当料液比为1∶40时达到最大值。这是由于茶叶需要吸收较多的水分才能充分溶胀，从而有利于色素的溶出；当料液比达到1∶40时，色素充分溶出，但是继续增加溶液量后，其他成分过多溶出反而不利于色素的提取。考虑到降低后续工序浓缩的能耗以及提高效率，料液比应该控制在1∶40以内。

图1　不同料液比对茶色素得率的影响Fig.1　Effect of liquid-to-material ratio on extraction rate of Xinyang Maojian tea pigment

2.1.2超声时间对茶色素得率的影响由图2可知，超声时间的延长对提高信阳毛尖茶色素的得率有一定的影响，在30～90min之间，得率呈上升趋势，而在90～150min之间得率趋于平衡。因此，提取时间宜控制在90～150min内。

图2　不同超声时间对茶色素得率的影响Fig.2　Effect of ultrasonic time on extraction rate of Xinyang Maojian tea pigment

2.1.3超声温度对茶色素得率的影响由图3可知，随着温度在30～120℃之间的升高，信阳毛尖茶色素的得率显著增加，其原因可能与温度越高，茶色素扩散到溶剂中的速度越快以及茶叶中本身含有的简单多酚氧化转化为聚合多酚形式的茶色素越多有关。从实际生产情况考虑，超声温度不宜超过100℃。

图3　不同超声温度对茶色素得率的影响Fig.3　Effect of ultrasonic temperature on extraction rate of Xinyang Maojian tea pigment

2.1.4提取次数对茶色素得率的影响由图4可知，信阳毛尖茶色素的得率受到提取次数的影响，随着提取次数的增多，得率增加，在提取3次后得率可以达到25.1%，但3次差异较小，所以本实验综合分析之后，选择提取1、2、3次来做进一步考察。

图4　提取次数对得率的影响Fig.4　Effect of extraction times on extraction rate

2.2信阳毛尖茶色素提取条件的优化

由表2可以看出影响茶色素得率的因素大小依次为A＞D＞C＞B，即料液比、提取次数、超声温度、超声时间。由正交实验可以得到各因素的最优组合为：A2B2C1D3，即料液比1∶30、超声时间120 min、超声温度80℃、提取次数3次。三次验证实验得率分别为：33.5%、33.1%、32.8%，平均得率为33.1%±0.4%。大于9组实验中的任意组，为最佳组合。

2.3信阳毛尖茶色素的DPPH自由基清除活性

在本实验中，抗氧化剂将稳定的DPPH自由基（紫色）还原为非自由基形式的DPPH-H（黄色）［19］。信阳毛尖茶色素的DPPH自由基清除活性的结果如图5所示。由图5可知，样品的DPPH自由基清除活性随着样品浓度的增加而增加。在样品浓度为100 μg/mL时，信阳毛尖茶色素的DPPH自由基清除活性是80.38%，明显低于VC（p＜0.05），VC是被公认的具有最强DPPH自由基清除活性［7］，因此信阳毛尖茶色素具有较强的DPPH自由基清除活性。

表2　正交实验的结果Table 2　Results of orthogonal test

图5　信阳毛尖茶色素的DPPH自由基清除活性Fig.5　Scavenging activity of Xinyang Maojian pigment and ascorbic acid at various concentrations on DPPH free radical

2.4信阳毛尖茶色素的超氧自由基清除活性

在本实验中，超氧自由基产生于PMS/NADH体系，并与NBT发生还原反应，通过测定反应混合物的吸光度值的降低来计算超氧自由基的清除活性。信阳毛尖茶色素的超氧自由基清除活性的结果如图6所示。由图6可知，随着样品浓度的增加，超氧自由基的清除活性逐渐升高。在样品浓度为100 μg/mL时，信阳毛尖茶色素的超氧自由基清除活性是85.33%，因此信阳毛尖茶色素具有较强的超氧自由基清除活性。

图6　信阳毛尖茶色素的超氧自由基清除活性Fig.6　Scavenging activity of Xinyang Maojian pigment and ascorbic acid at various concentrations on superoxide radicals

2.5信阳毛尖茶色素的羟基自由基清除活性

在本实验中，羟基自由基是通过Fenton反应体系产生的。羟基自由基能氧化Fe2+成为Fe3+，而只有Fe2+能和1，10-菲咯啉形成1，10-菲咯啉-Fe2+的复合体，因而通过测定反应体系吸光度值的降低可以计算出羟基自由基清除活性［20］。信阳毛尖茶色素的羟基自由基清除活性的结果如图7所示。由图7可知，随着样品浓度的增加，羟基自由基的清除活性逐渐升高。在样品浓度为100 μg/mL时，信阳毛尖茶色素的羟基自由基清除活性是88.68%，因此信阳毛尖茶色素具有较高的羟基自由基清除活性。

图7　信阳毛尖茶色素的羟基自由基清除活性Fig.7　Scavenging effects of Xinyang Maojian pigment and ascorbic acid at various concentrations on hydroxyl radicals

3　结论

采用信阳毛尖为原料，通过单因素实验，确定了在各因素水平下的最佳条件。由正交实验可以得到各因素的最优组合为：料液比1∶30、超声时间120 min、超声温度80℃、提取次数3次，此时茶色素的得率为33.1%±0.4%。因此，利用正交实验对信阳毛尖茶色素提取工艺进行优化，可获得最优的工艺参数，有效减少了工艺操作中的盲目性，从而为进一步的实验研究提供参考。

用分光光度法对信阳毛尖茶色素清除体外自由基的能力进行了测定，测定结果表明信阳毛尖茶色素对DPPH自由基、超氧自由基、羟自由基有较强的清除作用，其清除体外自由基的能力由强到弱依次是：羟自由基＞超氧自由基＞DPPH自由基。因此，信阳毛尖茶色素具有良好的抗氧化作用，可以作为一种天然的抗氧化剂。

［1］孙海涛，邵信儒.响应面法优化超声波提取山核桃壳色素工艺［J］.东北林业大学学报，2012，40（2）：74-77.

［2］周金伟，陈雪，易有金，等.不同类型茶叶体外抗氧化能力的比较分析［J］.中国食品学报，2014，14（8）：262-269.

［3］徐维盛，张桂雨，刘静，等.ORAC法评价16种茶叶的抗氧化能力［J］.食品安全质量检测学报，2014，5（1）：241-246.

［4］刘茹，马森.茶多酚和茶多糖清除羟基自由基的效果［J］.安徽农业科学，2012，40（3）：1463-1464.

［5］王刚，赵欣.两种白茶的抗突变和体外抗癌效果［J］.食品科学，2009，30（11）：243-245.

［6］范於菟，孔祥鹤，梅其炳.茶多酚抗骨质疏松的研究进展［J］.中国现代应用药学，2011，28（8）：717-720.

［7］刘礼军，杜万红.茶叶抗衰老机制研究进展［J］.现代预防医学，2014，41（14）：2537-2539.

［8］范红艳，王艳春，顾饶胜，等.茶多酚抗衰老的研究进展［J］.中国老年学杂志，2011，31（5）：893-895.

［9］范娟，许士凯.茶多酚药理作用的研究进展［J］.现代中西医结合杂志，2002，11（22）：2301-2302.

［10］杨晓萍，覃筱燕.茶多酚药理活性的研究进展［J］.中央民族大学学报：自然科学版，2013，22（3）：24-28.

［11］段宾宾，赵铭钦，刘鹏飞，等.响应面法优化优化信阳毛尖超声提取物提取工艺［J］.香料香精化妆品，2012，29（1）：7-11.

［12］韩艳霞，陈金峰.信阳毛尖茶多酚提取工艺研究［J］.化学世界，2011，52（6）：321-326.

［13］任健，杨志宏，刘钟栋.信阳毛尖茶多糖含量与提取得率的比较研究［J］.食品工业科技，2004，25（7）：49-51.

［14］张继英，张炎达，潘慧青.从信阳毛尖中提取咖啡因的工艺优化研究［J］.现代农业科技，2012，40（12）：275-279.

［15］陈丽如，张娜，杨更亮，等.茶色素的超声辅助提取及其稳定性研究［J］.江西农业大学学报，2010，32（3）：608-612.

［16］Duan Xiaojuan，Zhang Weiwei，Li Xiaoming，et al.Evaluation of antioxidant property of extract and fractions obtained from a red alga，Polysiphonia urceolata［J］.Food Chemistry，2006，95（1）：37-43.

［17］Liu F，Ooi VE，Chang ST.Free radical scavenging activities of mushroom polysaccharide extracts［J］.Life Sciences，1997，60（10）：763-771.

［18］Jin M，Cai Y，Li J，et al.1，10-Phenanthroline-Fe2+oxidative assay of hydroxyl radical produced by H2O2/Fe2+［J］.Progress in Biochemistry and Biophysics，1996，23（6）：553-555.

［19］Floegel A，Kim DO，Chung SJ，et al.Comparison of ABTS/ DPPHassaystomeasureantioxidantcapacityinpopular antioxidant-rich US foods［J］.Journal of Food Composition and Analysis，2011，24（7）：1043-1048.

［20］Wang Jing，Liu Li，Zhang Quanbin，et al.Synthesized oversulphated，acetylated and benzoylated derivatives of fucoidan extracted from Laminaria japonica and their potential antioxidant activity in vitro［J］.Food Chemistry，2009，114（4）：1285-1290.

Research of ultrasound-assisted extraction of Xinyang Maojian tea pigment and its antioxidant activity

LI Bin，WU Xiao-xue，MENG Yao-yao，WANG Li-bo
（College of Biological and Chemical Engineering，Nanyang Institute of Technology，Nanyang 473004，China）

Objective：To optimize the extraction process for Xinyang Maojian tea pigment and explore its antioxidant activity.Methods：Effect of four factors on the extraction，including ratio of solid to liquid，ultrasonic temperature，ultrasonic time and extraction times were studied by single factor and the optimum extraction conditions were then determined through the orthogonal experiment.1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH）free radical scavenging assay，superoxide and hydroxyl radical scavenging assay were used to evaluate the antioxidant activity of the pigment.Results：The order of factors to affect flavonoids extraction was ratio of material/solution＞extraction times＞ultrasonic temperature＞ultrasonic time.The optimal extraction conditions were material/solvent ratio 1∶30，extraction temperature of 80℃and extraction time of 120 min，for three times.Under such conditions，the yield of the melanin reached 33.1%.The Xinyang Maojian tea melanin exhibited a moderate antioxidant activity.It was clearly demonstrated that free radical scavenging increases with increasing melanin concentration. The melanin had strong scavenging activity on hydroxyl radical.Conclusion：The extraction rate of Xinyang Maojian tea pigment was improved by orthogonal experiment.The pigment had antioxygenation effect obviously，and it could be further developed and utilized as a natural antioxidant.

Xinyang Maojian tea；tea pigment；extraction；antioxidant activity

TS202.3

B

1002-0306（2015）18-0281-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.048

2015-01-30

李斌（1984-），女，博士，讲师，研究方向：食品生物技术，E-mail：binbin27_lee@163.com。