温度和pH对不同镰刀菌生长及产毒的影响

师　　雯，韩　　铮，武爱波，王周平（1.江南大学食品学院，江苏无锡141；.上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所，上海01403）

温度和pH对不同镰刀菌生长及产毒的影响

师雯1，2，韩铮2，武爱波2，王周平1，*
（1.江南大学食品学院，江苏无锡214122；2.上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所，上海201403）

以从小麦、玉米、大米、大麦等作物中分离得到的12株不同种类的镰刀菌菌株为研究对象，探究不同温度和pH对其生长及产毒的影响。结果表明，镰刀菌在10～35℃和pH3～11范围内均能够生长，最适温度为20～30℃，最适pH为6～8。供试镰刀菌能够产生的毒素主要为A型单端孢霉烯族毒素、B型单端孢霉烯族毒素、伏马毒素和镰刀菌酸，产毒温度为5～40℃，但不同菌株的最适产毒温度存在差异；产毒过程受pH影响较大，过酸（pH3～5）及过碱（pH9～11）的条件下均未检测到任何毒素。总体上看，不同种类镰刀菌产毒类型存在差异，毒素产量受温度和pH影响比生长更大，且大多数菌株的生长与产毒最适条件并不一致。

镰刀菌，温度，pH，生长，产毒

镰刀菌属（Fusarium Link.）为半知菌类真菌，瘤座孢科，丛梗孢目，因大型分生孢子多呈镰刀状而得名［1］，其种类较多，地理分布极广，兼寄生或腐生生活，普遍存在于土壤及动植物有机体内，是农作物和经济作物最重要的病原菌之一；它们对寄主植物具有一定生理活性和非专化性作用位点，破坏植物细胞膜及超微结构［2］，造成萎蔫、根腐、穗腐等病害，如Fusarium graminearum、Fusarium equiseti能引起小麦和大麦赤霉病；Fusarium verticilloides［3］、Fusarium proliferatum［4］可引起玉米穗腐病；Fusarium oxysporumSchlecht可引起瓜类、茄科、豆科等多种植物枯萎病［5］等，导致作物产量降低甚至绝产，严重影响品质和食用价值［6］。镰刀菌在自然生长过程中还能产生多种真菌毒素，通过食品、饲料等途径进入食物链，侵染大米、玉米等谷物，食用油、面包、啤酒等农产品加工品，以及蛋、奶、肉等畜产品，导致人类和动物食物中毒甚至死亡［7］。据相关统计，全世界每年由于镰刀菌及其毒素侵染农作物和工业原料使各国遭受的经济损失可达数千亿美元［8-9］，因此镰刀菌引起的作物病害及其毒素给人类和动物饮食安全带来的危害已成为不可忽视的问题，明确其生长和产毒的环境因素是有效控制镰刀菌及其毒素的关键。

镰刀菌的生长和产毒与外界环境条件密切相关［10］，本实验以从小麦、玉米、大米、大麦等作物中分离得到的12株不同种类的镰刀菌为研究对象，系统地探究不同温度及pH对其生长和产毒的影响，明确最适生长和产毒条件，及产毒类型的种间差异，为镰刀菌引起的植物病害及食品储存中毒素污染的防治技术提供一定理论参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

供试镰刀菌菌株信息见表1，均由上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所提供，实验前于4℃保存在PDA斜面上；甲醇、乙腈色谱纯，德国Merck公司；醋酸铵色谱纯，上海安普生物科技有限公司；氯化钠、无水硫酸镁分析纯，国药集团化学试剂有限公司（上海）；脱氧雪腐镰刀烯醇（DON）、3-乙酰基脱氧雪腐镰刀烯醇（3-ADON）、15-乙酰基脱氧雪腐镰刀烯醇（15-ADON）、雪腐镰刀烯醇（NIV）、镰刀菌烯酮-X（Fus-X）、T-2毒素（T-2）、HT-2毒素（HT-2）、新茄镰刀孢醇（NEO）、蛇形毒素（DAS）、伏马毒素B1（FB1）、伏马毒素B2（FB2）、镰刀菌酸（Fusaric acid）标准品美国Sigma公司；马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Potato Dextrose Agar，PDA）马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15～20 g、蒸馏水1000 mL、自然pH，121℃灭菌20 min；马铃薯葡萄糖肉汤（Potato Dextrose Broth，PDB）马铃薯200 g、葡萄糖20 g、蒸馏水1000 mL，121℃灭菌20 min。

表1　供试镰刀菌菌株信息Table 1　Information of Fusarium strains in this study

MJ-250F-1霉菌培养箱、DHG-9240A鼓风干燥机上海天呈实验仪器制造有限公司；SW-CJ-2FD超净工作台上海博讯实业有限公司；PE20pH计上海梅特勒-托利多仪器有限公司；SX-500TOMY高压灭菌锅上海田源生物技术有限公司；LCMS-8030三重四极杆液质联用仪日本岛津（SHIMAADAU）有限公司。

1.2实验方法

1.2.1菌株活化将4℃封存于PDA斜面上的镰刀菌菌株分别接种于新配制的PDA固体培养基平板，25℃活化培养7 d；再将活化后的各菌株菌丝转接于新配制的PDA培养基上，25℃恒温培养7 d，保证菌种活力，并用灭菌打孔器从新鲜菌落边缘切取直径为6 mm的菌饼，用于接种。

1.2.2温度对镰刀菌生长及产毒的影响采用菌丝生长速率法测定温度对镰刀菌生长的影响。将15 mL PDA培养基倒入直径为9 cm的培养皿中，待冷却凝固后，每皿正中接入一块菌饼，菌丝面朝下，分别于5、10、15、20、25、30、35和40℃的温度条件下恒温培养，相对湿度保持恒定，每个处理重复3次。培养7 d后，采用十字交叉法测量菌落直径，以两次测量的平均值作为测量结果，减去菌饼直径（6 mm）即为菌落直径；再将PDA培养基连同已知质量的培养皿一同从培养箱中取出，并于40℃的烘箱中烘烤48～60 h后称重，当培养基的质量烘至1.0 g时，从培养皿中取出，移至50 mL离心管，捣碎并进行毒素提取和测定。

1.2.3pH对镰刀菌生长及产毒的影响采用菌丝体干重法测定pH对镰刀菌生长的影响。将100 mL PDB培养基分装入250 mL三角锥瓶中，灭菌后用磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L Na2HPO4-0.1 mol/L柠檬酸缓冲液和0.05 mol/L Na2HPO4-0.1 mol/L NaOH缓冲液）将pH分别调至3、4、5、6、7、8、9、10和11。每瓶接入一块菌饼，于25℃下恒温静置培养，相对湿度保持恒定，每个处理重复3次。培养7 d后，用已知质量的无菌滤纸滤去培养基，收集菌丝体，于40℃下烘干至恒重，准确称量，减去滤纸质量即为菌丝体干重；将培养基滤液振荡均匀，吸取1.0 mL于50 mL离心管中进行毒素提取和测定。

1.2.4LC-MS/MS毒素检测方法镰刀菌毒素提取和检测均采用本实验室前期已建立的LC-MS/MS分析检测技术，样品前处理、色谱及质谱参数参照文献［11］。

1.3数据处理

应用SPSS17.0（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）和Graphpad prism 5.0（Graphpad Software，Inc.，San Diego，CA）等统计分析软件对实验数据分析整理。实验结果用平均值±标准偏差（mean±SD）表示，数据间差异显著水平以p＜0.05表示。

2　结果与讨论

2.1温度和pH对镰刀菌生长影响

2.1.1温度对生长影响镰刀菌菌株在不同温度条件下培养7 d后的菌落直径见表2，由结果可知，同一温度下不同菌株的生长速率存在差异（p＜0.05），但不同温度下的生长趋势具有相对一致性。镰刀菌对温度适应范围较宽，菌丝在10～35℃温度范围内均可生长；但对温度变化较为敏感，不同培养温度下同一菌株的菌落扩展速率差异显著（p＜0.05），其中20～30℃为最适宜生长温度范围，菌丝生长较快，除F.tricinctum最适生长温度为20℃外，其他菌株均为25℃；温度低于20℃或高于30℃时，菌丝生长逐渐缓慢；而当温度降至5℃或达到40℃时，菌丝停止生长。

表2　不同温度对镰刀菌菌丝生长的影响（n=3）Table 2　Effect of different temperatures on mycelia growth of Fusarium fungi（n=3）

表3　不同pH对镰刀菌菌丝生长的影响（n=3）Table 3　Effect of different pH values on mycelia growth of Fusarium（n=3）

2.1.2pH对生长影响镰刀菌菌株在不同pH条件下培养7 d后的菌丝体干重见表3。由结果可知，同一pH下不同菌株生长速率存在差异（p＜0.05），但不同pH下的生长趋势具有相对一致性。镰刀菌生长对pH要求不严格，pH3～11范围内均能够生长；但在不同pH条件下，同一菌株的菌丝体干重差异显著（p＜0.05），其中pH6～8为最适宜生长酸碱度，但各菌株最适生长pH存在差异；当pH小于6或大于8时，菌丝体生长逐渐缓慢，表明过酸或过碱的培养环境不利于镰刀菌的生长，而中性或中性略偏酸碱的环境则能使其更好生长。

2.2温度及pH对镰刀菌产毒影响

2.2.1温度对产毒影响不同种类的镰刀菌产生毒素的种类不相同，主要包括B型单端孢霉烯族毒素（NIV、Fus-X、DON、3-ADON及15-ADON）（图1）、A型单端孢霉烯族毒素（T-2、HT-2、NEO及DAS）（图2）、伏马毒素（FB1、FB2）及镰刀菌酸（Fusaric acid，图3～图4）；同一种镰刀菌毒素可由多种镰刀菌产生，每种镰刀菌的产毒种类也并不单一。

从图1~图3可知对大多菌株而言，温度为5℃时，不产毒或产毒量很低；温度从5℃升高至15℃，产毒量随温度升高而缓慢增加；在20～35℃范围内，各菌株的产毒量显著升高，并达到产毒最高点；温度达到40℃时，产毒量回落到底点。然而，F.langsethiae和F.sporotrichioides的产毒趋势有所不同（图2），温度为10～25℃时，两株菌株的产毒量达到高点，而在25～35℃温度范围内，产毒量则很低。对比不同温度条件下不同镰刀菌的产毒情况，发现温度对镰刀菌产毒的影响比对生长的影响更加复杂，并且不同菌株的最适产毒温度及产毒能力存在明显差异。

图1　不同温度对产B型单端孢霉烯族毒素镰刀菌产毒的影响Fig.1　Effect of different temperatures on mycotoxins production of Fusarium species of type-B trichothecenes producer

2.2.1.1产B型单端孢霉烯族毒素菌株由图1可知，F.culmorum、F.poae及F.meridionale主要产生NIV和Fus-X两种毒素，F.graminearum能够产生DON及其乙酰化衍生物。F.culmorum在20℃时产毒量最大（NIV：212.00 μg/kg，Fus-X：43.74 μg/kg），30℃次之；F.poae在25℃时产毒水平最高（NIV：612.71 μg/kg，Fus-X：135.75 μg/kg）；F.meridionale则在30℃时具有最大产毒量（NIV：346.53 μg/kg，Fus-X：38.57 μg/kg），且显著高于25℃和35℃；而F.graminearum的最适产毒温度则为30℃（DON：15919.70 μg/kg，3-ADON：7763.06 μg/kg，15-ADON：5194.82 μg/kg）。

图2　不同温度对产A型单端孢霉烯族毒素镰刀菌产毒的影响Fig.2　Effect of different temperatures on mycotoxins production of Fusarium species of type-A trichothecenes producer

2.2.1.2产A型单端孢霉烯族毒素菌株由图2可知，F.langsethiae、F.sporotrichioides和F.polyphialidicum主要产A型单端孢霉烯族毒素。F.langsethiae在15℃时产毒量最高（T-2：5089.32 μg/kg，HT-2：347.10 μg/kg，DAS：411.799 μg/kg，NEO：2478.05 μg/kg），20℃次之；F.sporotrichioides和F.polyphialidicum的最适产毒温度分别为15℃和25℃。

2.2.1.3同时产伏马毒素（FB1、FB2）和镰刀菌酸菌株由图3可知，F.fujikuroi、F.proliferatum和F.verticillioides能够同时产生FB1、FB2和镰刀菌酸。F.fujikuroi的最适产毒温度为25℃（FB1：17.15 μg/kg，FB2：3.43 μg/kg，镰刀菌酸：2.06 μg/kg），其次为30℃；F.proliferatum和F.verticillioides则在30℃时产毒量最大。

图3　不同温度对同时产伏马毒素和镰刀菌酸的镰刀菌产毒的影响Fig.3　Effect of different temperatures on mycotoxins production of Fusarium species of fumonisins and fusaric acid producer

图4　不同温度对产镰刀菌酸的镰刀菌产毒的影响Fig.4　Effect of different temperatures on mycotoxins production of Fusarium species of fusaric acid producer

2.2.1.4产镰刀菌酸菌株由图4可知，F.tricinctum和F.oxysporum仅检测到镰刀菌酸一种毒素。30℃为F.tricinctum的最适产毒温度，产毒量为171.93 μg/kg，其次是25℃；而F.oxysporum的最适产毒温度则为35℃，产毒量为212.98 μg/kg。

值得注意的是，大多数菌株的产毒最适温度与各自的最佳生长温度不一致；尤其在10～20℃和30～35℃温度范围内，有些菌株的生长水平逐渐降低，但产毒水平依然较高。Ramirez等［12］发现小麦培养基中，F.graminearum最佳生长温度为25℃，DON的最大产毒量温度为30℃，此时菌株的生长速率显著降低；Nazari等［13］报道F.langsethiae和F.sporotrichioides的最适生长温度分别为20～25℃和25～30℃，而最适产毒温度则为10～15℃，此时菌株生长极为缓慢；这些报道与本文研究结果一致，可见食品及饲料中即使没有明显的菌株生长迹象，但可能已存留了大量真菌毒素；此外，低温条件下（5℃）菌丝生长基本停止，但部分镰刀菌仍然能够产生少量毒素，说明食物长期低温存放也并非绝对安全。

镰刀菌毒素是镰刀菌在自然生长过程中产生的具有毒性的次级代谢产物，也可认为是其因外界环境改变而产生的适应反应，因此其毒素的产生往往同细胞生长及外界环境等因素密切相关［7］；可能正是因为细胞内利于菌株生长的物质和参与毒素合成的代谢物对不同温度的敏感程度不同，从而导致各菌株的最适生长与产毒条件存在差异。

2.2.2pH对产毒影响镰刀菌的产毒对酸碱度较为敏感，pH3～5和pH9～11范围内均未检测到任何毒素；产毒主要出现在pH6～8范围内（表4），与生长适宜范围一致，表明中性或中性略偏酸碱的环境有利于镰刀菌的产毒，但最佳产毒pH与各自最佳生长pH依然存在差异。

表4　不同pH下镰刀菌产毒水平（n=3）Table 4　Levels of mycotoxins produced by Fusarium under different pH values（n=3）

3　结论

分析不同温度和pH对镰刀菌生长及产毒情况的影响，结果表明，相同培养条件下不同镰刀菌的生长速率存在差异，但在不同温度或pH下的生长趋势具有相对一致性，镰刀菌在10～35℃和pH3～11范围内均能够生长，最适温度及pH范围为20～30℃和pH6～8。不同镰刀菌产毒类型存在差异，产毒温度为5～40℃，但不同菌株之间最适产毒温度不相同；产毒过程受pH影响较大，过酸（pH3～5）及过碱（pH9～11）的条件下均未检测到任何毒素。因此，镰刀菌毒素的产生受温度和pH影响比生长更大，且大多数菌株的生长与产毒最适条件并不一致。由于本研究中得到的镰刀菌生长和产毒适宜条件与很多作物栽培区的环境条件基本一致［14-15］，建议在作物种植时，适当调节土壤酸碱度（pH），及时修剪残株病枝，注意镰刀菌病害的防控；食品及饲料储存时也要注意温度控制，减少镰刀菌毒素的产生和蔓延；该研究结果也为镰刀菌及其毒素发生规律的进一步研究提供了一定理论依据。

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Effect of temperature and pH on the growth and mycotoxins production of various Fusarium species

SHI Wen1，2，HAN Zheng2，WU Ai-bo2，WANG Zhou-ping1，*
（1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Institute for Agri-food Standards and Testing Technology，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201403，China）

In order to investigate the influences of temperature and pH value on the growth and mycotoxins production of various Fusarium species，a total of 12 strains，which isolated from wheat，maize，rice and barley，were studied in present study.The results showed that a wide range of 10～35℃and pH3～11 suitable for their growth were observed，and the optimum temperatures and pH values range were 20～30℃ and pH6～8. Different types of mycotoxins including type-A trichothecenes，type-B trichothecenes，fumonisins and fusaric acid were produced by the Fusarium investigated in current study.The temperature for the mycotoxins production was in the range of 5～40℃.The mycotoxin production were significantly affected by the variation in pH values，and peracid（pH3～5）or parlkaline（pH9～11）conditions would inhibit mycotoxins synthesis.On the whole，the mycotoxins production profiles were various between different Fusarium species，and more effects of temperature and pH values were observed on the mycotoxins production than that on the growth of fungi.For most Fusarium strains，the optimum conditions for mycotoxins production were inconsistent with the Fusarium growth itself.

Fusarium；temperature；pH；growth；mycotoxin production

TS201.6

A

1002-0306（2015）18-0117-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.015

2015－02－02

师雯（1989-），女，硕士研究生，研究方向：食品安全检测，E-mail：sw1596321@sina.com。

王周平（1974-），男，教授，研究方向：食品安全检测，E-mail：wangzp@jiangnan.edu.cn。

国家自然科学基金（31471661）。