食品中邻苯二甲酸酯类化合物检测方法研究进展

张文文　周金慧

（中国农业科学院蜜蜂研究所；农业部蜂产品质量监督检验测试中心，北京100093）

食品中邻苯二甲酸酯类化合物检测方法研究进展

张文文周金慧

（中国农业科学院蜜蜂研究所；农业部蜂产品质量监督检验测试中心，北京100093）

邻苯二甲酸酯类化合物（phthalic acid esters，简称PAEs）主要用于提高食品塑料包装物的韧性和耐用性，在一定的条件下这些化合物会迁移至食品中去，从而干扰人体激素的分泌，在体内长期积累可导致畸形、癌变和突变。本文对近年来国内外食品中的内分泌干扰物邻苯二甲酸酯类化合物检测方法的研究进展进行了综述，概括了食品中PAEs的样品前处理技术和检测技术的发展近况，并特别对蜂产品中PAEs检测分析发展进行了展望。

食品，蜂产品，内分泌干扰物，邻苯二甲酸酯类化合物

邻苯二甲酸酯类化合物（PAEs）属于内分泌干扰物（Endocrine Disrupting Chemicals，简称EDCs），包括邻苯二甲酸二甲酯（Dimethyl Phthalate，简称DMP）、邻苯二甲酸二乙酯（Diethyl Phthalate，简称DEP）、邻苯二甲酸二正丁酯（Dibutyl Phthalate，简称DBP）、邻苯二甲酸二异丁酯（Diisobutyl Phthalate，简称DIBP）、邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（Dinoctylo Phthalate，简称DEHP）和邻苯二甲酸丁苄酯（Benzyl Butyl Phthalate，简称BBP）等［1］，多为无色油状粘稠液体，不溶于水，溶于大多数有机溶剂，易燃，其结构式如下图所示。

图1　邻苯二甲酸酯类化合物结构式

（其中R和R’为烷烃或芳香烃）

目前，国内市场上的很多食品、药品（如矿泉水、牛奶、蜂蜜、胶囊等）均采用塑料包装，其优点是成本低、质量轻、运输安全方便等。塑料依据材质不同可分为聚对苯二甲酸乙二醇酯（Polyethylene Terephthalate，简称PET），高密度聚乙烯（High Density Polyethylene，简称HDPE），聚氯乙烯（Polyvinyl Chloride Polymer，简称PVC），聚乙烯（Poly Ethylene，简称PE），高聚物聚丙烯（Polypropylene，简称PP），聚苯乙烯（Polystyrene，简称PS）以及其他一些种类［2］。而为了提高弹性、韧性、柔软性和耐用性，塑料瓶在生产过程中通常会加入邻苯二甲酸酯类化合物，它在塑料制品中可以较好地与塑料分子相溶，因此被广泛地作为增塑剂应用于塑料包装行业中［3］。邻苯二甲酸酯通过摄入进入生物体并在体内积累，但是并不直接作为有毒物质给生物体带来危害，而是以类似雌激素的方式使生物体内分泌失调，对人体和动物体危害的临床表现为生殖器障碍、生殖能力下降、行为异常、幼体死亡等，严重时导致物种灭绝［4］。

为了使消费者免受PAEs的危害，欧洲、美国和加拿大的一些专家组对这类物质进行风险评估分析后，制定出了PAEs每日可耐受摄入量：欧洲为0.02～0.37 mg/kg（体重）/天；美国为0.02～7 mg/kg/天；加拿大为0.044～0.06 mg/kg/天［5，6］。我国卫生部于2011年6月1日发布了第16号公告，将PAEs列入第六批“食品中可能违法添加的非食用物质‘黑名单’”［7］。并于2012年6月13日发布了卫生部办公厅关于通报食品及食品添加剂中PAEs类化合物最大残留量函（即卫办监督函［2011］551号）：规定了食品、食品添加剂中的DEHP、DINP、DBP最大残留量分别为1.5、9、10.3 mg/kg［8］。为了保证食品安全，除了良好的风险管理和监督，有效的检测技术也是十分必要的。

1　样品前处理技术

现已报道的适用于分离纯化食品中邻苯二甲酸酯类化合物的样品前处理技术包括固相萃取法（SPE）［9，10，11，12，13］，固相微萃取法（SPME）［14，15，16，17］，液液萃取法（LLE）［18，19］，分散液液微萃取法（DLLME）［20］和浊点萃取法（CPE）［21］。

2.1固相萃取

固相萃取主要是使样品液体或悬浮液在压力或重力差的作用下通过固相萃取装置的萃取材料，修饰在萃取材料上的特定官能团能够将样品中的目标物吸附，最后再通过洗脱萃取装置或加热等方式将目标离子分离出来，最终实现目标物与样品基质和杂质的分离和自身富集。Yan［18］等采用分子印迹-固相萃取技术分离、纯化塑料瓶装功能饮料中的DEP、BBP、DIOP、DNOP，首先在固相萃取空墨盒装入微球，接着用甲醇和水调节墨盒，然后样品溶液与甲醇和水（1:9，体积/体积）混合后通入墨盒，最后用EA进行洗脱，收集洗脱物并浓缩。0.5～750 μg/L范围内线性关系良好，在三个添加水平上的平均回收率为84.3～96.2%，相对标准偏差小于5.49%。

固相萃取具有操作简单，富集倍数高，有机溶剂消耗少，可自动划批量处理等优点。但是，不同批次吸附剂的效率不同，会影响分析结果的重复性，若发生不可逆吸附会导致样品中目标物的损失，有时还会发生表面降解反应，吸附剂堵塞孔道等问题。

2.2固相微萃取

固相微萃取是基于固相萃取发展起来的新型分离技术，其萃取装置为涂布可以吸收或吸附目标物涂层的纤维，将萃取装置暴露于液体样品中，并加以搅拌提高萃取效率，待达到平衡后直接进行脱附、分析。Zhu［24］等采用固相微萃取技术对产后6个月的人奶中的DEHP、DBP、DEP进行了分离净化，首先将牛奶样品放入内衬材料为聚四氟乙烯/有机硅的SPEM小瓶，然后90℃搅拌加热60 min，期间用微纤维管在小瓶上方收集目标物。

与固相萃取相比，固相微萃取无需填充柱和解吸附操作，从而也无需有机溶剂，样品用量少。但萃取装置的涂层使用寿命短并且价格昂贵，合成选择性强、灵敏度高的新型萃取纤维是未来的发展方向，分子印迹化合物作为新型涂层，开发潜力巨大。

2.3液液萃取

液液萃取根据目标物在不同有机溶剂中的溶解度不同实现分离，再通过净化去除杂质，得到目标物。吴惠勤［28］等采用液液萃取法，以正己烷、乙腈溶剂为萃取剂对碳酸饮料、植物油、孢子粉、柠檬香精、蜂王浆软胶囊等食品中的21种PAEs进行了萃取分离，不含油样品直接与正己烷漩涡混合，静置分层，上清液即为目标物；含油样品与含10%叔丁基甲醚的乙腈充分旋涡混合，静置分层，上清液加入氧化铝玻璃萃取管中涡旋混合，离心取上清液浓缩即为目标物；油脂样品用乙腈提取2次，离心，收集乙腈层，倒入氧化铝玻璃萃取管中涡旋混合，离心取上清液浓缩即为目标物。21种邻苯二甲酸酯的质量浓度在0.1～100 mg/L范围内呈良好线性，相关系数不低于0.9992，方法的定量下限（S/N= 10）为0.05～0.5 mg/kg。在0.10～10 mg/kg加标水平下的回收率为83～106%，相对标准偏差（RSD，n=6）为2. 9～5.5%。

液液萃取的最大优点是操作简便，但是有机溶剂消耗大，耗时长，回收率低，乳化现象严重，难以实现自动操作，并且会对环境造成二次污染。

2.4分散液液微萃取

分散液液微萃取是一种建立在三相溶剂体系基础上的萃取技术，将含有合适分散剂的萃取剂注入到样品溶液中，在分散剂作用下，萃取剂以微滴的形式分散于样品溶液中形成乳浊液，由于接触面积大，样品溶液中的目标物很快被萃取到萃取剂微滴中，通过离心使微滴沉淀于试管底部，实现分离。M.A.［30］等采用分散液液萃取，使用氯化钠和乙腈分别作为分散剂和萃取剂，对牛奶中的PAEs进行了分离纯化。最优条件下，检测限和定量限分别为1.5～3 ng/mL和2.5～11 ng/mL，富集系数均在397～499的范围内，在100 ng/mL下各邻苯二甲酸酯的相对标准偏差（N=6）均在3～4%的范围内。

分散液液微萃取适用于亲脂性高或中等（K＞500）的分析物，最大的特点是萃取剂使用量小，且与样品溶液的接触面积大，富集倍数很高，从而萃取效率大大提高，特别适用于痕量样品分析中。但是，目前分散液液微萃取大部分仍为手动操作，难以实现自动操作和在线联用等技术。开发新型的萃取剂和分散剂、建立与各种检测器匹配的联用方法和拓展分析物及分析物基质的范围，是分散液液微萃取技术未来的发展方向［22］。

2.5浊点萃取

浊点萃取是一种新兴的液液萃取技术，它以中性表面活性剂胶束水溶液的溶解性和浊点现象为基础，表面活性剂分子一端为亲水基团，一端为疏水集团，当外界环境参数（如温度）改变时引发相分离，从而实现亲水性物质和疏水性物质的分离。陆敏［31］等采用浊点萃取法对一次性塑料袋中的DEP、DMP、DBP进行了分离净化，首先将塑料袋碎片加入超纯水，超声过滤后加入10%TritonX-114和NaCl，定容后在60℃水浴槽恒温75 min，之后离心15 min，相分离后，弃去水相，将表面活性剂相用甲醇溶解定容，得到目标物。最佳条件下DMP、DEP、DBP的质量浓度在0.529～52.88μg/mL、0.617～61.74μg/mL、0.534～53.42 μg/mL范围内线性关系良好，相关系数分别为0.9996、0.9998、0.9999。

浊点萃取不使用挥发性的有机溶剂，因而对环境友好；操作简单，便于实现联机操作；萃取效率和富集率高，并且能够保护被萃取物质的原有特性。值得注意的是，浊点萃取在与其他检测技术联用时，可能会由于胶束相的黏度太大而影响样品的浓缩因子，并且表面活性剂对于紫外光的具有较强的吸收背景，影响分析结果。开发选择性强、适用范围更广的表面活性剂是浊点萃取技术的发展方向。

上述萃取方法各有优缺点，可根据食品的种类选择合适的样品前处理方法，其最终目的是减少共流出物对待测物质的干扰，提高方法的准确性，重现性，精密度，减少基质效应和样品之间的交叉污染。

2　检测技术

现有的可用于检测邻苯二甲酸酯类化合物分析方法包括紫外分光光度法、荧光光度法、薄层色谱分析法、气相色谱法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用分析法（LC-MS/MS）和气相色谱-质谱联用分析法（GCMS）。但是，紫外分光光度法、荧光光度法、薄层色谱分析法由于定性定量能力和选择性较差，实际分析中很少使用；常用的检测方法主要为气相色谱法、高效液相色谱法和气相色谱/高效液相色谱-质谱联用技术。

3.1气相色谱法

气相色谱法是利用样品中各组分在固定相与流动相中受到的作用力不同，而将目标物与样品基质和杂质分离的一种方法，能够分离理化性质极为相似的组分，所以常用于PAEs的检测。曹小妹［23］等采用气相色谱法测定食品塑料包装材料中的邻苯二甲酸酯类化合物，载气为纯度99.99%的高纯氢、流量30mL/min、进样口温度250℃、检测器温度280℃，柱温采用程序升温。分流比1:10，进样量1μL。所建立方法，线性相关系数在0.9986～0.9994之间；回收率在80.63～95.50%之间；DBP、BBP、DCHP和DEHP的检测限分别是0.050 μg/mL、0.010 μg/mL、0.055 μg/mL和0.012 μg/mL。

气相色谱法可用于检测在-196～450℃范围内有一定蒸汽压的组分，检测限高达10-13-10-17 g，分析过程只需几分钟到几十分钟，但是在没有纯样品的条件下，对未知物的准确定性和定量较困难，往往需要与红外、质谱等联用。

3.2高效液相色谱法

高效液相色谱法与气相色谱法定性定量原理完全一样，差别在于流动相为液体，因此比气相色谱多了一个可供选择的重要操作参数，更利于测定条件的优化。张明明等［24］建立了检测食用油中邻苯二甲酸酯总量的高效液相色谱方法。首先将食用油中邻苯二甲酸酯转化为邻苯二甲酸，经正己烷萃取弃除脂肪酸，再用乙酸乙酯萃取邻苯二甲酸，旋转蒸发浓缩，用甲醇溶解，C18色谱柱分离，紫外检测器分析，流动相为甲醇-磷酸盐缓冲溶液（浓度25 mmol/L，pH 2.5）进行梯度洗脱，总流速为1 mL/min；柱温：40℃；进样量:10 μL，测定邻苯二甲酸的含量，并进一步估算出邻苯二甲酸酯的总含量，所建立的方法相对标准偏差为2.67～9.51%，回收率在79.12～110.01%之间。

高效液相色谱法和气相色谱各有所长，相互补充，但是色谱法总体存在灵敏度较低，特异性较差的缺点，所以不适合食品等复杂基质中PAEs的分析。

3.3气相色谱/高效液相色谱-质谱联用分析技术

质谱法能够根据离子碎片的质合比不同对物质进行准确定性，与色谱法联用能够克服色谱法难以定性的缺点。气相色谱/高效液相色谱-质谱联用分析技术具有较高的准确度和灵敏度，前处理比较简单，样品用量也少，可以同时测定多种PAEs化合物，并且能够进一步排除实际样品中出现的杂质干扰，最终获得检出限更低、准确度更高的最佳实验结果。这些分析方法涉及的样品种类主要包括方便面包装物［25］、水产品［26］、食用油［27］、饮用水［28］、蜂蜜、蜂王浆［29］和食品包装材料［30］等。

Guo［40］等采用LC-MS:C18色谱柱，流动相为0.1%甲酸的甲醇溶液，梯度洗脱，ESI离子源，多反应监测（MRM），GC-MS:Rxi-5ms石英毛细管柱，EI离子源，选择离子扫描模式（SIM），检测了肉、面粉、火腿和水果中9种PAEs；李婷［35］等采用GC-MS:Rxi-5MS谱柱，EI离子源，选择离子扫描模式（SIM）检测了奶茶和方便面调味包中17种PAEs，得到加标回收率为82.2～125.4%，70.9～115.5%；相对标准偏差分别小于16.5%和9.8%；方法检出限分别为100～200 μg/L，400～800 μg/L。

3蜂蜜和蜂王浆中PAEs的检测

目前，国内关于蜂产品中PAEs的研究还很少，周金慧等［39］建立了一种线性范围宽，准确度和精密度良好，基体效应控制得当的PAEs检测方法，对市售的十种蜂蜜和十种蜂王浆中的22种PAEs进行了分离净化和检测。样品前处理采用液液萃取法，首先准确称取5.0 g蜂蜜样品加入10 mL纯水用漩涡混合器混合成均匀液体，然后用10 mL正己烷分液萃取两次，取上清液蒸干，残余物用1 mL正己烷溶解定容；1 g蜂王浆用10 mL正己烷/丙酮（1:1，V/V）分液萃取两次，取上清液蒸干，残余物用1 mL正己烷溶解定容。检测采用气相色谱—质谱联用法，对十种蜂蜜和蜂王浆中PAEs定性定量分析，仪器条件：载气为氦气，线流速为37 cm/s；不分流进样，进样口温度为250℃；升温程序为初始温度90℃，以15℃/min升温至210℃，保持1 min，再以5℃/ min升温至240℃，保持5 min，再以5℃升温至250℃，再以25℃升温至300℃，保持4 min；质谱仪离子源温度230℃，接口温度280℃。采用选择离子监测（SIM）模式进行数据的采集。结果表明：十种蜂蜜和蜂王浆中PAEs的平均回收率在80.1～110.9%间；相对标准偏差小于12.7%，检测结果如下。

表1　10种蜂蜜和蜂王浆中PAEs检出比例（%）

表2　10种蜂蜜和蜂王浆中PAEs含量最大值（ng/g）

4　对策建议

由于邻苯二甲酸酯类化合物在实验室环境、仪器设备和溶剂当中均有一定的背景含量水平，所以准确地测量食品样品中含量很低的PAEs成为一项很艰难的任务。在保证和控制质量的基础上，简化操作步骤，采取充分的预防措施减少分析过程中的背景污染物含量，是目前检测分析食品中PAEs的关键所在。

蜂产品样品预处理应该朝着更为简单、快速、高通量的方向发展，并开发如纳米技术、膜处理技术等新型前处理技术，提高对样品中靶标物PAEs的富集能力；检测方面应该引入色谱-高分辨质谱、串联质谱联用、电喷雾离子化质谱等技术提高对结构相似的化合物和同分异构体的分离。

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The development of detection methods of phthalic acid esters in food

Zhang WenwenZhou Jinhui
（Institute of Apicultural Research，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Bee Product Quality Supervision and Testing Center，Ministry of Agriculture，Beijing 100093，P.R.China）

Phthalic acid esters，used mainly to improve the toughness and durability of food plastic packaging，under certain conditions，can migrate into food，interfere the human hormone secretion and lead to deformities，cancer and mutations if they long-term accumulate in the body.This study reviews the progress of the detection methods of phthalic acid esters in food and summarizes the development of the situation of sample pretreatment methods and detect methods domestic and abroad in recent years，and especially discuss the development of detection of PAEs in beehive product.

food，beehive product，Endocrine Disrupting Chemicals，PAEs

国家自然科学基金项目（31201859）

周金慧，副研究员，主要研究方向为蜂产品中污染物高通量筛查，定量及其代谢组学研究。E-mail：zhoujinhui@caas.cn