蜜蜂巢脾蜂胶复合生物制剂抑制温棚作物真菌类病害的试验研究

2015-11-03程瑛张世文刘彩云黄斌毛玉花逯彦果

中国蜂业 2015年9期

关键词：生物制剂巢脾蜂胶

程瑛　张世文　刘彩云　黄斌　毛玉花　逯彦果

（甘肃省蜂业技术推广总站，天水741020）

蜜蜂巢脾蜂胶复合生物制剂抑制温棚作物真菌类病害的试验研究

程瑛张世文刘彩云黄斌毛玉花逯彦果

（甘肃省蜂业技术推广总站，天水741020）

番茄病害是露地、保护地作物常见且比较难防治的真菌类病害，为了使其得到有效控制，从而提高产品的品质与产量，本研究拟采用蜜蜂巢脾、蜂胶及中草药为主要原料，筛选出一种能抑制番茄真菌类病害生长繁殖的生物制剂。经在实验室进行抑制真菌试验，抑菌率达到80%以上。

蜜蜂巢脾；蜂胶；生物制剂；番茄；真菌病害；抑菌

蜜蜂巢脾是蜜蜂栖息、繁衍育子、贮存食物的场所，当一个巢脾繁育过十几代蜂后，需要更换新的巢脾，被废弃的陈旧巢脾药用性在于它上面的茧衣、残留的蜂产品、幼虫分泌物等。陈旧蜂巢浸液对真菌等都有很强的抑制力，能预防经济作物很多生理性病害。

蜂胶是工蜂从植物幼芽或树干上采集来的树脂、树液、植物色素和挥发油，并混入其上颚腺分泌物和蜂蜡等加工而成的一种芳香性胶状固体物。它对致病细菌、真菌、病毒、原虫等，有抑制或杀灭作用，具有“天然广谱抗生素”美称。

中草药苍耳子属菊科一年生草本植物。其煎剂对金黄色葡萄球菌有一定的抑菌作用，其丙酮或乙醇提取物对红色毛癣菌也有抑菌作用。黄连属多年生草本，大黄是多年生高大草本，均具有抗菌消炎抗病原微生物等作用，有效成分分别为小檗碱、黄连碱、大黄酸、大黄素、芦荟大黄素等。

随着城市化进程的加快，人们对蔬菜的需求猛增，出现了种植番茄的专业村和专业基地，但由于品种单一，倒茬困难，致使连作现象非常严重，多年的连茬栽培使田间番茄病害的基数逐年增多。这就为某些病虫害的发生提供了有利条件，其中以灰霉病、早疫病、晚疫病等最为典型，病原分别由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、茄链格孢（Alternaria solani）、致病疫霉（Phytophthora infestans）侵染引起，有逐年加重的趋势。此类病菌繁殖迅速，危害番茄的整个生育期和全株，其防治主要依赖化学药物，但长期单一、大量和连续地使用，势必会造成植物的抗药性，而超量使用化学农药又会导致严重的“3R”问题。只能轮换、交替或混合使用化学杀菌剂，才能取得较好的控制效果。但是却没有得到全面有效的防治，仍是番茄病害及储存番茄腐烂的重要因素。因此，本研究拟在实验室提取并筛选蜜蜂巢脾、蜂胶及中草药混合物为天然复合制剂，对温棚番茄灰霉菌、早疫病及晚疫病等真菌类病害具有较高防治效果，且对人畜无毒害，不污染环境，对目标生物具有安全无污染的特点。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1蜜蜂巢脾

蜂场采集的中、意蜂老巢脾；蜂胶：蜂场采集的毛胶；中草药（黄连、苍耳子、大黄）：市售；无水乙醇、聚乙二醇400（PFG400）、聚山梨酯80（T80）等。

1.1.2供试菌种

采集甘肃省天水市武山县漆家庄马师傅家的温棚患有真菌类的农作物（选择茄果类蔬菜如番茄、茄子等），经过在实验室分离筛选、纯培养，并观察其菌落形态、镜检所得的灰霉菌（Botrytis cinerea）、早疫病菌（Alternaria solani）以及晚疫病（Phytophthora infestans）菌种。

供试品种：秦蔬一号。

1.1.3培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基），黑麦培养基。

1.1.4仪器

恒温滋力搅拌器（78HW-1型）、显微镜（DN-117M）、高压蒸汽灭菌锅、隔水式电热恒温培养箱、超净工作台（SW-CJ-ID型）、旋转蒸发仪（PE-52A）、移液器、牛津杯、平皿、电炉子、水浴锅等。

1.2实验材料提取方法

1.2.1蜜蜂巢脾浸提液的提取方法

将废旧巢脾在-20℃冷冻→粉碎→按1:4（W/V）的物料比，取已粉碎的老巢脾，加水（或50%、95%加醇）→熬煮20min（或浸泡）→过60目筛→滤液静止冷却→过200目筛→将已制得的样品放入旋转蒸发仪上进行蒸馏，放入冰箱冷藏备用。

1.2.2蜂胶乙醇液的提取

粗蜂胶500g→砸碎→按1:4（W/V）的物料比、加食用酒精2000ml→浸泡（约7d左右）→过筛（去蜂尸、木屑、蜡渣）→加入螯合剂（除铁屑等重金属）→静置→吸滤→蜂胶乙醇液。

1.2.3中草药液

将中草药分别粉碎，各称取50g，用纱布包好，加水500ml，煮沸30min，过滤，滤渣中加水250ml，煮沸约20min，过滤，合并两次滤液，用旋转蒸发仪浓缩以上药液，分别至50ml（即1ml提取物相当于1g原药），封口，放于冰箱冷藏保存。

1.2.4蜜蜂巢脾复合制剂（以下简称生物制剂）工艺流程

分别量取一定量的蜂胶加入乳化剂（聚乙二醇-400、T-80）在恒温磁力搅拌器上搅拌约40min，加巢脾液和中草药液，搅拌1h，温度50℃，充分搅拌，装瓶。

1.2.5正交试验

确定了巢脾、蜂胶以及中草药提取液三种因素的组成比例，见表1。

1.3抑菌实验方法

牛津杯法（管碟法）抑菌方法。

1.3.1制平板

将培养基加热融化，待冷却至55～60℃时，在超净工作台上给每个平皿（专用培养皿内径90mm，高16～17mm）先倒入15ml的PDA培养基（为底层）；将灰霉病菌、早疫病菌及晚疫病菌等分别培养至平板的2/3大时，在无菌条件下，用接种针刮取孢子，倒入放有数粒玻璃珠的三角瓶中，摇5min，（用灭菌的双层纱布过滤于另一个灭菌的三角瓶内。用低倍镜检查，调节孢子浓度，每个视野80～100个孢子为宜）。将已制备好的孢子悬液取3ml，加入另一个三角瓶中，向其中倒入冷却至50℃的30ml的培养基，充分混匀。立即取5ml带菌培养基加在已凝固的琼脂培养基上，使其均匀铺在已有15ml的平板上。

表1　水平因素表

1.3.2药液选取

根据正交试验每种病菌配制有九组样品，灭菌水为对照。

1.3.3实验

用灭菌镊子取不锈钢小管（即牛津杯，外径8.0mm，内径6.0mm，高10mm），每个平板内中央放1个小管，周围等距离放3个小管，其中央一个为对照，加入无菌水，周围3个小管加不同浓度的药液。用记号笔标记，重复两组实验，放入26℃左右的恒温箱中培养，观察。经培养5～7天后，取出平板，用直尺十字交叉法测量菌丝生长直径（见表2）。

2　结果与分析

2.1抑菌实验

2.1.1将采用不同提取方法提取的蜜蜂巢脾液、蜂胶液及中草药液进行抑菌实验，结果如表2所示。其中1号样是水提法提取的蜜蜂巢脾浸提液，2号样是95%醇提法提取的蜜蜂巢脾浸提液，3号样是50%醇提法提取的蜜蜂巢脾浸提液，4号样为蜂胶乙醇液，5号样为苍耳子、黄连、大黄中草药复合提取液。

通过对蜜蜂巢脾液、蜂胶乙醇液以及中草药液等进行抑菌实验，产生对灰葡萄孢菌、茄链格孢菌、致病疫霉菌的抑菌圈，可以看出，蜂胶乙醇液对灰葡萄孢菌、茄链格孢菌、致病疫霉菌有较强的抑制作用，其次为采用水提法提取的巢脾液及中草药提取液均对其有

表2　蜜蜂巢脾、蜂胶及中草药对番茄真菌类病害的抑制效果

抑菌效果。所以采用水提法提取的巢脾液、蜂胶乙醇液以及中草药液作为复合生物制剂的原料。

2.1.2根据三因素三水平的正交试验（无交互作用）条件下配制生物制剂，以PEG400溶液为有机相，采用T80作为复合乳化剂，共配制9组样品。见表3。

2.2.3将所配制的复合生物制剂进行抑菌实验，结果见表4。

通过生物制剂在培养基中的扩散作用，产生对病菌的抑菌圈。从表4可以看出，D号样品抑制灰霉病效果最强，G号样品抑制早疫病效果最强，A号样品抑制晚疫病效果最强。

表3　巢脾、蜂胶、中草药正交试验表

2.2.3不同稀释倍数的抑菌实验

将筛选出D号样（水平组合A2B1C2）、G号样（水平组合A3B1C3）、A号样（水平组合A1B1C1）的复合生物制剂分别用灭菌水稀释为20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%等不同浓度，灭菌水为对照。化学农药为阳性对照。采用牛津杯法，进行抑制灰霉病、早疫病、晚疫病的抑菌实验，结果见表5。

由表5及图1可以得出，不同浓度的生物制剂均有不同的抑菌效果，将D号样稀释成50%浓度时，抑制灰霉菌效果明显较强，稀释成60%浓度时，虽然抑菌效果也有增加，但是抑菌效果不太显著；G号样稀释成40%浓度时，抑制早疫病效果较强；A号样稀释成40%浓度时，抑制晚疫病效果较强；抑菌效果与浓度成正相关，且随着浓度的增加抑菌效果越强。遵循低成本高效益的原则，选择稀释浓度为50%的D号样为抑制灰霉病最佳生物制剂配方；选择稀释浓度为40%的G号样为抑制早疫病最佳生物制剂配方；选择稀释浓度为40%的A号样为抑制晚疫病最佳生物制剂配方。