急性髓系白血病NPM1和FLT3基因突变与临床特点的关系

吴凌颖，马建华，范进婷，赵 芳，冯雅青

（大同市第三人民医院变态反应科，山西大同 037008）

急性髓系白血病NPM1和FLT3基因突变与临床特点的关系

吴凌颖，马建华，范进婷，赵 芳，冯雅青

（大同市第三人民医院变态反应科，山西大同 037008）

目的研究伴有NPM1和FLT3-ITD突变基因急性髓系白血病患者的临床特点。方法对67例初诊AML患者进行NPM1基因突变和FLT3-ITD基因突变检测，比较其结果。结果NPMl突变阳性患者占所有AML患者的10.4%，占核型正常AML患者的26.1%；FLT3-ITD基因突变阳性占所有AML患者的10.4%，占核型正常AML患者的17.4%。NPMl突变阳性患者和NPMl突变阴性患者相比，初诊时血小板、AML-M5比例、CD34阳性患者比例、染色体核型正常比例、伴有特殊融合基因患者的比例、伴有FLT3-ITD突变阳性患者的比例等指标差异均有统计学意义。而FLT3-ITD基因突变阳性患者就诊时白细胞数和骨髓原始细胞比例明显高于阴性患者。结论对初诊时核型正常AML患者检测NPM1和FLT3-ITD基因突变，有利于预后评估和指导治疗。

白血病;非淋巴细胞;急性；基因，NPMl，FLT3-ITD；DNA突变分析

核仁磷酸蛋白（NPM1）基因突变是急性髓系白血病（AML）最常见的基因突变，发生率为25%～35%，在正常核型AML患者中突变率更高，正常核型伴NPM1突变的AML患者已被NCCN指南列为预后良好组。FMS样酪氨酸激酶3(FLT3)基因内部串联重复(ITD)是近年在急性髓系白血病(AML)患者中发现的常见突变类型，在AML中的发生率为15%～35%，大量研究显示，FLT3突变与外周血高白细胞、骨髓高白血病细胞比例有关，是AML的重要预后影响因素。当AML患者同时出现以上2种突变时，文献报道预后较差。我们对67例AML患者进行资料分析，了解其临床特点，印证其与疗效的关系。

1 病例与方法

1.1 病例来源

201105-201405期间大同市第三人民医院共收治67例AML患者，所有患者均进行骨髓形态学检查，并进行免疫分型、细胞遗传学和分子生物学检查。所有患者诊断均符合急性髓系白血病诊断标准[1]。其中男31例，女36例，中位年龄47(4～79)岁。FAB分型M11例，M216例，M316例，M410例，M518例，M63例，M72例，MDS/AML1例。分子生物学检测包括融合基因如AMLl-ETO,PMLRARα,CBFB-MYHll，NPMl和FLT3-ITD基因突变。AML-M3采用全反式维甲酸联合亚砷酸的诱导方案，其他类型AML的诱导化疗方案应用阿糖胞苷联合蒽环类药物为主的方案，如DA，MA，IA，HMA，CAG等。

1.2 染色体核型分析

骨髓细胞经过24～48 h培养后，收集细胞常规制片，G显带，根据《人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN，1995)》进行核型分析。

1.3 四色流式细胞术检测免疫表型

仪器采用美国BD公司FACS Calibur型流式细胞仪，单克隆抗体和配套试剂为美国BD公司试剂，分析采用CellQuest Pro软件。根据初治时白血病特异免疫表型进行随后的跟踪随访。

1.4 PCR-毛细管电泳法检测NPM1和FLT3-ITD

取患者的骨髓单个核细胞标本，采用DNA提取试剂盒（美国，AXYGEN BIOSCIENCES公司产品），按说明书提取基因组DNA，分光光度仪检测产物浓度和纯度，并用去离子水稀释样品至50 ng/μL备用。NPM1基因的扩增引物参照文献[2]设计合成。NPM1基因第12外显子引物:上游引物5′-TG⁃GTTCCTTAACCACATTTCTTT-3′;下 游 引 物 5′-CAAGACTATTTGCCATTC-CTAAC-3′,上游引物5′标记FAM(6-羧基荧光素),产物长度为478 bp。同时参照文献[3]设计FLT3引物:上游引物5′-GCAATTTAGGTATGAAAGCCAGC-3′;下 游 引 物5′-CTTTCAGCATTTTGACGGCAACC-3′,上游引物5′标记TAMRA(6-羧基四甲基若丹明)荧光素,扩增产物长度329 bp。采用多重PCR的方法在20 μL反应体系中同时扩增NPM1和FLT3基因,在ABI PRISM 310型基因分析仪上进行毛细管电泳。电泳结果在329 bp(FLT3)及478 bp(NPM1)出现单峰,若在329 bp之后出现额外的峰提示存在FLT3-ITD突变,若在478 bp后约482 bp处出现额外的峰提示NPM1突变。提取送检标本中基因组DNA,使用超保真DNA聚合酶和AB9700型PCR仪进行基因扩增,使用AB3500XL型基因测序仪进行序列测定和片段长度分析,用VariantReporterⅤ1.1分析基因突变情况。

1.5 融合基因

提取送检标本中有核细胞总RNA,并反转录为cDNA,用AB9700型PCR仪和巢式PCR方法扩增送检标本中的上述基因,用2%～3%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

1.6 疗效评价

诱导化疗后据外周血象恢复情况，在3～4周进行骨髓检查进行疗效评估，完全缓解(CR)给予巩固化疗。部分缓解(PR)和原始细胞下降大于50%者给予第2次诱导化疗，2个疗程后再进行疗效评价。

1.7 统计学处理

应用SPSSl6．0统计学软件进行统计分析。计数资料采用Mann-Whitney非参数检验和独立样本t检验，计量资料采用x2检验及FISH确切概率法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NPMl和FLT3-ITD基因突变率和FAB分型分析

在67例初诊AML患者中，共检测出NPMl突变阳性患者7例(10.4%)，其中NPMl A型突变5例、B型突变1例、K型突变1例，A型突变比例最高，占71.4%。NPMl突变阳性者AMl-M11例、AMl-M22例、AML-M54例。均以AML-M5患者居多；FLT3-ITD突变阳性患者7例(10.4%)，FLT3-ITD突变阳性者AMl-M31例、AMl-M41例、AML-M55例。

2.2 NPMl和FLT3-ITD基因突变者染色体核型分析

在核型正常患者23例(34.3%)中，检出NPMl突变阳性者6例(26.1%)，FLT3-ITD突变阳性者4例(17.4%)。在核型异常患者44例中，NPMl突变阳性者1例(2.3%)，FLT3-ITD突变阳性者3例(6.8%)；FLT3-ITD和NPMl同时突变阳性患者2例，均染色体核型正常。3例FLT3-ITD基因突变阳性异常核型分别为 t(15；17)(q22；q21)、inv(16)（p13；q22）和47，XY,+3；1例 NPMl突变阳性异常核型为 46，XY，del 9(q13-q22)。NPMl基因突阳变性在核型正常组中的阳性率明显高于核型异常组（P＜0.05）；而FLT3-ITD基因突变阳性虽在核型正常组中的阳性率高于核型异常组，但差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.3 NPMl和FLT3-ITD基因突变阳性者与阴性者的一般资料比较

结果见表1和表2。将67例患者按NPMl和FLT3-ITD基因突变情况分为4组，NPMl+/FLT3-ITD+2例，NPMl-/FLT3-ITD+5例，NPMl+/FLT3-ITD-5例，NPMl-/FLT3-ITD-55例。5例单纯FLT3-ITD突变阳性初诊时WBC和骨髓原始细胞比例明显高于55例突变阴性患者，差异有统计学意义（P＜0.05）；与NPMl-/FLT3-ITD-组相比，余3组发病年龄、初诊血红蛋白浓度均高于此组，但差异均无统计学意义(P＞0.05)；NPMl+/FLT3-ITD-组初诊BPC数量高于其他3组，但差异均无统计学意义(P＞0.05)。

表1 7例NPMl突变阳性和60例NPMI突变阴性患者的一般资料比较

表2 基因突变阳性和突变阴性患者的一般资料比较

2.4 NPMl和FLT3-ITD基因突变阳性者与阴性者的治疗效果比较

62例可统计疗效的患者中，5例伴单独NPMl突变阳性和50例NPMl-/FLT3-ITD-患者2个疗程CR率分别为80%和78%，2组差异无统计学意义；5例伴单独FLT3突变阳性和50例NPMl-/FLT3-ITD-患者2个疗程CR率分别为40%和78%，2组差异无统计学意义；5例伴单独FLT3突变阳性和2例伴NPMl+/FLT3-ITD+患者2个疗程CR率分别40%和100%，2组差异无统计学意义。

2.5 核型正常伴突变阳性和阴性者的治疗效果比较

22例可统计疗效的患者中，4例伴单独NPMl突变阳性和14例NPMl-/FLT3-ITD-患者2个疗程CR率分别为100%和64.3%，2组差异无统计学意义；2例伴单独FLT3突变阳性和14例NPMl-/FLT3-ITD-患者2个疗程CR率分别为0%和64.3%，2组差异无统计学意义；2例伴单独FLT3突变阳性和2例伴NPMl+/FLT3-ITD+患者2个疗程CR率分别0和100%，虽差距显著，但病例较少，2组差异无统计学意义。

3 讨论

我们对67例AML患者研究发现NPMl突变阳性的发生率为10.4%，占正常核型AML患者的26.1%。国外文献报道NPMl突变在AML患者中的发生率为25%～35%，而在核型正常AML患者中发生率高达38.6%～65.2%[4-6]。国内吴德沛等[7]报道86例初诊AML患者中NPMI突变发生率为33.7%，占核型正常患者的46%；而黄晓军等[8]报道206例初诊AML患者中NPMI突变发生率为15.5%，占核型正常患者的32.5%，与本研究结果基本一致。本研究结果显示NPMl突变阳性的初诊AML患者临床特点如下：血小板计数高、AML-M5比例高、核型正常比例高、伴有FLT3-ITD突变阳性的比例高；而CD34阳性患者比例低、伴有特殊融合基因患者比例低、核型正常单独NPM1阳性缓解率高于无突变组，A型突变最常见，与文献报告基本相符[5，9]。Konstanze D 等[10]研究显示，NPM1突变阳性女性患者多见，容易合并牙龈增生、淋巴结肿大、LDH增高等，本研究未发现上述特点。Thie⁃de C等[11]研究显示，FLT3基因突变，特别是ITD突变与AML患者的临床特点及预后相关。979例AML患者中FLT3-ITD突变发生率为20.4%、占核型正常患者的32.3%、占核型异常患者的9.9%，FLT3-ITD突变患者初诊外周血白细胞计数高、骨髓原始细胞比例高，FAB分型多为AML-M5，而AML-M2及AML-M6患者少，与本研究结果基本一致。

国外许多学者对NPM1和FLT3-ITD突变阳性在AML患者中的预后意义进行研究。NPM1突变导致白血病发生的原因仍未完全清楚，可能是由于突变扰乱NPM1核仁定位信号，导致其在细胞质中的积累，从而形成恶性转换中的关键一步[10]；NPM1突变阳性AML患者根据是否伴有FLT3-ITD突变分为2个预后完全不同亚群，NPMl突变阳性FLT3-ITD阴性患者对化疗敏感，CR率高[11]。我们的研究显示，核型正常AML患者伴单独NPMl突变阳性者比NPMl，FLT3-ITD同时阳性者CR率偏高，与其结论相符。原因可能是NPMl突变后导致NPMl野生型蛋白功能下降，特别对p53诱导凋亡的保护作用降低，另外蒽环类药物可诱导NPMl野生型蛋白胞质异常定位，从而导致白血病细胞容易凋亡[11]。Sehlenk RF[9]文献报道，核型正常小于60岁的AML患者，NPM1+／FLT3-ITD-者第1次完全缓解后，造血干细胞移植对预后无明显影响，NPM1+／FLT3-ITD+者行异基因外周血造血干细胞移植是最好选择；由于随访时间较短，本实验中未对NPM1，FLT3-ITD突变与AML患者总体生存期和无病生存期的关系进行研究，随后的研究将对此方面进行统计。

综上所述，临床上检测NPM1及FLT3-ITD基因突变对AML患者治疗及预后均有指导意义。

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〔责任编辑 杨德兵〕

The Clinical Characteristics of Acute Myeloid Leukemia Patients with NPM1 and FLT3 Mutations

WU Ling-ying,MA Jian-hua,FAN Jin-ting,ZHAO Fang,FEN Ya-qing
（Department of Hematology,The Third People Hospital,Datong Shanxi,037006）

Objective To investigate the clinical characteristics of acute myeloid leukemia(AML)with NPM1 and FLT3 mutations.Methods NPM1 and FLT3 mutations were detected in 67 patients with newly diagnosed AML by PCR-capillary electrophoresis.Results The incidence of NPM1 mutation was 10.4%in total AML patients and 26.1%in normal karyotypes AML patients.The inci⁃dence of FLT3-ITD mutation was 10.4%in total AML patients and 17.4%in normal karyotypes AML patients.The characteristics of 60 NPMl wild type patients V.S.that of 7 NPMl mutation patients was as followed,among BPC,proportion of AML-M5,incidence of CD34+,normal karyotypes,cases with fusion gene,incidenee of FLT3-ITD-positive.no statistic difference was found in WBC counts,percentage of blasts in bone marrow,sex,median age,complete remission rate between the two groups.The WBC counts,percentage of blastsin in bone marrow in the FLT3-ITD+patients were clearly higher than that in the FLT3-ITD-patients.Conclusions It is neces⁃sary to detect NPMl mutation and FLT3-ITD in newly diagnosed AML patients,especially in patients with normal karyotype,which might help to molecular classification and treatment.

leukemia,nonlymphoeytic,acute;gene,NPM1,FLT3-ITD;DNA mutational analysis

R557

A

1674-0874(2015)03-0043-04

2015-03-12

吴凌颖（1967-），女，山西大同人，硕士，副主任医师，研究方向：血液病。