大麻籽内生菌果胶酶的菌株筛选初探

王齐玮， 吴 宁， 杜官本， 李晓平,*， 李文均

（1.云南省木材胶黏剂及胶合制品重点实验室，云南 昆明 650224；2. 云南大学 生命科学学院 云南省微生物研究所，云南 昆明 650091）

果胶是一种多糖类物质，在植物中含量较少但非常重要，主要分布在植物细胞的胞间层和初生壁中，起着粘结植物细胞的作用。果胶在植物细胞组织中与纤维素、半纤维素、木质素和蛋白质等相互交联，使细胞组织结构坚强，表现出固有的形态[1]。

果胶酶就是指可以分解果胶的一类酶的总称，许多霉菌及少量的细菌和酵母菌都可产生果胶酶，主要以曲霉和杆菌为主[2-4]。传统的纤维分离和纤维素提纯通常是采用酸碱处理、热磨法、爆破法、机械法和传统微生物法等，不仅需要专门的设备、耗时耗能、还会形成二次污染。果胶酶被研究应用于纺织、造纸等领域[5-7]，但仅在实验室内取得了成功，其根本原因就是木质材料中复杂的化学成分容易导致果胶酶失去活性、不能发挥作用，导致将果胶酶应用于纺织、造纸等领域时成本高、效率低、质量不稳定；另外木质材料的自然pH值一般在5.5～6.5范围内，而现有果胶酶最适pH值一般在3.5～4.0范围；为了筛选出适于木材加工用的果胶酶，项目组尝试在工业大麻籽的内生菌中寻找一株高产果胶酶的菌株，以期用于木材加工的领域。

内生菌是一种特殊的微生物，其生活在植物体细胞内或细胞间隙这样一个特殊环境中，植物与其内生菌之间的内生关系早在高等植物出现在地球上的时候就已开始发展。在高等植物漫长的演化过程中，其内生菌与其宿主都在协同进化，完全适应宿主植物的内部环境，若能利用该种微生物开发果胶酶，则有望制备出一种不受宿主植物任何化学成分影响，在纤维分离过程中可以保持其活性，实现高效利用的特种生物酶。本研究的目的就是从“云麻1号”大麻籽中筛选出一批果胶酶高产内生菌株，为制备出一种适应木质材料自身pH环境，在pH5.5～5.8之间具有较高酶活性的木材加工专用果胶酶奠定基础。

1 实验

1.1 材料

实验中采用的实验材料包括大麻籽、工业大麻秆和果胶酶，具体如下：

大麻籽和工业大麻秆，均选用“云麻1号”大麻籽和工业大麻秆，由云南工业大麻股份有限公司提供。

果胶酶：购买了市面上四种果胶酶，分别是德国 merck公司生产的果胶酶（适用 pH3.5～4.0；活性30 000 U/g），国产BBI公司生产的果胶酶（适用pH3.5～4.0；活性30 000 U/g），上海蓝季公司生产的果胶酶（适用pH3.5～6.0，活性30 000 U/g）和南京都莱生物有限公司生产的果胶酶（适用pH3.5～4.0，活性30 000 U/g）。

1.2 方法

1）工业大麻籽内生菌的分离纯化：大麻籽经过严格的表面消毒后[8]，置于垫有定性滤纸干燥的培养皿中，利用严格消过毒的粉碎机进行粉碎，用竹签夹起0.1～0.3 g均匀撒于MS分离培养基上，28℃培养八周；用YIM38#培养基进行菌株分离纯化。MS培养基的配方为：1 000 mL培养基中的具体成分包括大量元素（母液1）50 mL，微量元素（母液2）5 mL，铁盐（母液3）5 mL，有机成分（母液4）5 mL，葡萄糖30 g，琼脂粉14 g；YIM38#培养基的配方为：1 000 mL培养基中各化学成分的含量为微量盐2 mL，酵母粉4 g，果胶4 g，麦芽粉3 g，琼脂14 g。

2）果胶酶生产菌株的筛选：从分离纯化好的菌株中用竹签挑取菌株点在YIM38#培养基平板上，置于37℃培养箱，培养24 h后，加入1%碘溶液染色，染色30 min以后倒去碘溶液，再加浓度为 0.9%的生理盐水，洗涤 1小时后观察，菌落周围有透明圈形成的即为可以生产果胶酶的菌株（如图1所示），取透明圈与菌落直径比较大的菌株进一步进行果胶酶的液体发酵以制备出酶液。

3）微生物的菌株鉴定：本实验所获取的可以产果胶酶的菌株均为芽孢杆菌，所以采用16S rRNA法来进行菌株的鉴定，鉴定的步骤具体如下：利用酶解法小量提取DNA[8]，选用 PA/PB 引物（PA: 5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’; PB:5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’）进行 PCR 扩增（94℃1 m；56℃ 30 s；72℃ 1 m，33个循环），扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶检测后送上海生工进行测序，序列回来之后经EzTaxon-e网站进行比对（http://eztaxon-e.ezbiocloud.net）[9]。

4）果胶酶液体发酵和酶活测定：利用液体发酵法制备果胶酶溶液，用无菌竹签将菌龄 24 h、一个火柴头大小的菌体挑入发酵液中，放入摇床摇72 h，设定温度37℃，转数200 r/min；果胶酶液体发酵培养基所采用的培养基配方如下： 1 000 mL培养基中各化学成分的含量为酵母粉4 g，果胶0.4 g，葡萄糖3.6 g，麦芽粉3 g。采用DNS法进行酶活测定[10]，向15 mL具塞试管中加入0.8 mL 1.0%的果胶溶液，于50℃水浴下保温3 min，然后加入一定稀释倍数的发酵上清液0.2 mL，反应10 min，再加入DNS试剂3 mL，混匀，沸水浴10 min，立即冷却定容至15 mL，540 nm测定吸光值。空白用煮沸失活的发酵上清液代替。活力定义为：上述实验条件下，每小时水解果胶产生1 mg还原糖（以半乳糖醛酸计）所需酶量定义为一个酶活力单位（U），测试pH值为5.5。另外选取南京都莱生物有限公司生产的果胶酶，测定不同pH值条件下（pH值分别为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0）果胶酶的活性，分析不同pH值条件下果胶酶活性的变化情况，以此说明pH值对果胶酶活性的影响。

图1 果胶酶阳性菌株产生的透明圈

5）果胶酶处理对工业大麻杆物理结构的影响观察：取2～5 mm长，2～3 mm宽，2～3 mm厚的工业大麻杆若干，分别放入自制果胶酶发酵液和市场上购买的四种果胶酶溶液中，50℃下水浴4 h，再放入104℃烘箱中烘4 h至其绝干，将处理后的样品放在电子显微镜下观察。采用的扫描电镜为荷兰FEI公司生产的环境扫描电镜（型号Quanta200），喷镀仪为日本日立公司（HITACHI）生产（型号E-1010）。

2 结果与讨论

2.1 产果胶酶菌株的鉴定结果和酶活测定

利用MS培养基从工业大麻籽中获得菌株60余株，主要为芽孢杆菌和链霉菌；利用碘染色法，初步筛选获得10株产果胶酶的菌株，经过液体发酵复筛得到7株产果胶酶的菌株，利用DNS法测得果胶酶的酶活，测试结果如表1所示，通过16S rRNA基因序列分析鉴定7株菌均属于芽孢杆菌属，具体菌种还有待进一步鉴定。由表1可以看出，果胶酶的酶活在pH5.5条件下都不是很高，主要原因可能如下，首先采用的液体培养基配方和发酵条件没有经过优化，第二菌株为从工业大麻籽内生菌中筛选得到，没有进行果胶酶制备的定向培育和诱导，最后用于测试果胶酶的酶液是没有经过纯化的粗果胶酶溶液。后面的研究将进一步针对上述的不足进行优化和纯化。

表1 菌株鉴定和酶活的测试结果

2.2 不同果胶酶处理对工业大麻杆物理结构的影响

利用果胶酶活性最高的菌株HS032发酵制备的果胶酶溶液对工业大麻杆样品进行处理，利用扫描电镜观察自制果胶酶溶液的处理效果并与市场上购买到的4种果胶酶对工业大麻杆样品的处理效果进行对比，如图2～图7所示。

图2 未经处理的工业大麻杆结构

图3 大麻杆样品经HS032菌株果胶酶处理

图4 大麻杆经蓝季果胶酶处理

图5 大麻杆经Merck果胶酶处理

图6 大麻杆经BBI果胶酶处理

图7 大麻杆经都莱果胶酶处理

由图2可见，未经果胶酶处理的工业大麻杆结构致密，纤维之间排列整齐，经过果胶酶溶液处理之后，纤维之间都出现了不同程度的剥离和分离如图3～图7所示。这是由于，工业大麻杆是一种生物质材料，纤维细胞是其组成的基本结构单元，纤维与纤维之间主要靠胞间层和初生壁连接，胞间层的粘结物质主要是木质素和果胶质，初生壁中含有35%的果胶质，利用果胶酶溶液对其进行处理可以有效地降解纤维胞间层和初生壁中的果胶质，从而达到纤维分离的目的，所以经过果胶酶溶液处理后，工业大麻杆样品中原来排列致密的纤维细胞之间都出现了不同程度的剥离和分离，但是由图3～图7中可知，经工业大麻籽内生菌HS032菌株发酵制备的果胶酶溶液处理后的工业大麻杆样品其纤维的剥离程度最高，效果最好。而从市场上购买到的4种酶，对于工业大麻杆样品均有一定程度的剥离，但其剥离效果均不如自制的酶液效果好。这主要是因为，市场上现有的果胶酶主要都用于食品加工，其适用的pH值范围在3.5～4.0，而木质材料的自然pH值范围为5.5～6.0，下面将进一步分析pH值对果胶酶活性的影响，以阐述开发木材加工专用果胶酶的重要性。

2.3 pH值对果胶酶活性的影响

图8 pH值对果胶酶活性的影响

图 8是利用南京都莱生物有限公司生产的果胶酶测得，由折线图可以看出，pH4.0时果胶酶活性最高，随着pH值从4.0升高值7.0，果胶酶酶活显著降低，在pH7.0时果胶酶活性为0。由此可知原料酸碱性对果胶酶活性有很大的影响，木质材料的自然 pH值一般在5.5～6.5范围内，而现有果胶酶则在pH值为3.5～4.0范围内时最高，所以不能够对木质材料的纤维进行显著分离。同时木质材料的化学成分非常复杂，有很大一部分化学成分比如木质素、单宁、半纤维素等，可对普通的生物酶活性产生抑制作用，从而达到防治木质材料生物降解和腐朽的目的；另外还有种类复杂，含量较少的无机盐，均会对果胶酶的活性产生不利影响。但是，在高等植物漫长的演化过程中，其内生菌与其宿主都在协同进化，完全适应宿主植物的内部环境，若能利用该种微生物开发果胶酶，则有望制备出一种不受宿主植物任何化学成分影响，在纤维分离过程中可以保持其活性，应用于木材加工；所以利用 HS032号菌株利用液体发酵制备的果胶酶溶液酶活不高，但是在与市场上够得的4种果胶酶相比，其对工业大麻秆的分离效果最好。

3 结论

1）利用碘液初筛和液体发酵复筛，共从“云麻1号”大麻籽中筛选出7株产果胶酶的内生菌菌株，通过16S rRNA基因序列分析，菌株初步鉴定为芽孢杆菌属。

2）利用液体发酵，得到果胶酶的粗酶液，利用HS032号菌株的发酵液与市场上购买的4种果胶酶在相同条件下对工业大麻秆进行处理，通过扫描电镜观察可以看到自制果胶酶的纤维分离效果最好，即工业大麻籽内生菌产生的果胶酶对于工业大麻秆纤维细胞胞间层中的果胶降解效果最好。

3）市售来源于黑曲霉的果胶酶的活性受到环境酸碱性的影响非常显著，在 pH4.0时果胶酶的活性最高，随着pH值从4.0升至7.0，其活性迅速降低至0。

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