两种大蒜汁抑菌效果检测技术比较及评价
2015-10-31夏俊芳杨婷张珍珍武运古丽娜孜周咪房丹刘箐
夏俊芳,杨婷,张珍珍,武运,古丽娜孜,周咪,房丹,刘箐
(1.新疆农业大学食品科学与药学学院,新疆乌鲁木齐830052;2.新疆农业大学科学与技术学院,新疆乌鲁木齐830052;3.上海理工大学医疗器械与食品学院,上海200093)
两种大蒜汁抑菌效果检测技术比较及评价
夏俊芳1,杨婷1,张珍珍1,武运1,古丽娜孜1,周咪2,房丹2,刘箐3,*
(1.新疆农业大学食品科学与药学学院,新疆乌鲁木齐830052;2.新疆农业大学科学与技术学院,新疆乌鲁木齐830052;3.上海理工大学医疗器械与食品学院,上海200093)
抑菌能力是评价食品防腐效果的一项重要指标,不同的抑菌试验方法对食品防腐剂抗菌能力的评价有较大影响,因此,选用枯草芽孢杆菌和啤酒酵母为受试菌株分别采用牛津杯法和滤纸片法,分别对鲜榨蒜汁和4℃存贮7 d蒜汁抑菌效果进行评价,对大蒜汁抑菌特性进行研究,为大蒜汁的生物抑菌、防腐提供理论基础和工艺参数,同时为抑菌效果的评价做出科学、合理的判断。
鲜榨蒜汁;抑菌圈直径;牛津杯法;滤纸片法
大蒜是“地里长出来的抗生素”,具有天然广谱抗菌特性。大蒜中的抑菌活性成分主要是含硫化合物等挥发性物质及大蒜素等,具有很强的杀菌作用[1-3];目前国内外对大蒜抑菌、抗菌作用的研究报道集中于大蒜活性物质——大蒜油、大蒜素等对微生物的抑制方面[4-11],而不是用整个大蒜破碎后的汁液进行研究。大蒜油、大蒜素在提取中,自身天然活性会受到损失或改变,而且提取率较低,提取后的残留物不能再食用,造成原料的大量浪费,且提取后的大蒜油、大蒜素性质极不稳定,易失去活性,在生产中较难利用开发。若将完整大蒜采用榨汁方式获得完整榨汁液,对榨汁液抑菌效果进行评价分析,期望用榨汁液获得抑菌特性成果,同时为蒜汁抑菌评价方法的选择提供科学、合理的判断。
抑菌能力是评价食品防腐剂效果的一项重要指标,不同的抑菌试验方法对食品防腐剂抗菌能力的评价有较大影响,因此,本研究采用完整大蒜直接取汁,选用枯草芽孢杆菌和啤酒酵母为受试菌株采用两种评价方法(牛津杯和滤纸片法)对鲜榨和4℃7 d存贮期的蒜汁抑菌特性进行分析,为大蒜汁的生物抑菌、防腐提供理论基础和工艺参数,为大蒜的进一步开发利用生产食品保藏、防腐的天然生物防腐剂提供技术参考。
1材料与方法
1.1主要材料与仪器
1.1.1试验材料
新鲜白皮大蒜:购于新疆乌鲁木齐北园春农贸市场。
本研究选用引起番茄酱腐败的主要微生物:枯草芽孢杆菌及啤酒酵母(分别是导致番茄酱平酸腐败的嗜温需氧芽孢杆菌和导致番茄酱发生胀袋现象的发酵糖产酸产气的酵母代表属[12-14]为试验菌株,以上菌种均由新疆农业大学食品科学与药学学院微生物实验室提供。
营养琼脂培养基、YPD培养基:北京奥博星生物技术有限责任公司。
1.1.2仪器
DJ100—3型电子分析天平:上海恒平科学仪器有限公司提供;LRH—280型生化培养箱:上海森信试验仪器有限公司提供;LDZX—40SCI型高压灭菌锅:上海早安医疗器械厂产品;牛津杯(内径6mm,外径8mm,高10 mm)。
1.2方法
1.2.1菌悬液的制备
枯草芽孢杆菌和啤酒酵母菌株分别用营养肉汤37℃和28℃培养18 h倍比稀释,稀释倒平板计数确定细菌悬液浓度。枯草芽孢杆菌原菌液平均浓度是6.32×108CFU/mL,啤酒酵母原菌液平均浓度是9.8× 108CFU/mL,4℃冰箱中贮存备用。
1.2.2大蒜汁浓度制备
各种浓度大蒜汁的制备:取一定量的大蒜去皮于榨汁机中压榨成汁,再于离心机3 000 r/min离心20 min,取上清液作为100%的大蒜汁,采用二倍稀释法[13]用适量无菌水稀释成浓度为50%、25%、12.5%、6.25%、3.13%、1.57%的大蒜稀释液,用试管振荡器混匀、备用。
1.2.3采用牛津杯法对大蒜汁抑菌效果评价
吸取0.1 mL菌悬液涂布于双碟平皿,用无菌镊子镊取规格完全一致的不锈钢小管3个(即牛津小杯)置于含菌的琼脂平板上,然后用移液枪在2个牛津杯中加入一定浓度的大蒜汁溶液0.1 mL,吸取0.1 mL无菌蒸馏水加入剩下的牛津杯中作为空白对照,室温下静置5 min~10 min,正置平板于恒温培养箱中,枯草芽孢杆菌37℃,培养24 h,啤酒酵母28℃,培养24 h,测量抑菌圈直径并拍照记录结果。分别测量每一个抑菌圈两个垂直方向的直径大小,每个试验重复3次,记录各个重复的平均值。
1.2.3.1牛津杯法测不同浓度的大蒜汁对枯草芽孢杆菌和啤酒酵母的抑菌评价
参照1.2.3,取牛津杯,移液器加入梯度大蒜汁(100%、50%、25%、12.5%、6.25%、3.13%、1.57%)0.1 mL,测不同浓度的大蒜汁对两种菌的抑菌效果。
1.2.3.2牛津杯法测不同pH大蒜汁对枯草芽孢杆菌和啤酒酵母的抑菌评价
移取pH为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的磷酸缓冲液,与制备的大蒜汁混合,使所制备的大蒜汁终pH为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0,采用牛津杯法测定两种菌在不同pH下的抑菌圈大小。
1.2.4采用滤纸片法对大蒜汁抑菌效果评价
用打孔器将滤纸打成直径为0.88 cm的圆形纸片,经121℃高压蒸汽灭菌20 min后置于55℃~56℃烘箱内烘干。取滤纸圆片,置于大蒜汁中浸泡10 min,吸取0.1 mL菌悬液用无菌玻璃涂布器涂匀平皿,用无菌镊子镊取两个上述浸泡至饱和滤纸圆片,在瓶壁上沥去多余溶液,无菌操作放入测试培养基平板表面,并以无菌蒸馏水浸泡的滤纸片作为空白对照,室温下静置5 min~10 min,使菌液吸附进培养基,倒置平板与恒温培养箱中枯草芽孢杆菌37℃培养,啤酒酵母菌28℃培养,测量抑菌圈的直径。数据统计与处理,分别测量每一个抑菌圈两个垂直方向的直径大小,每个试验重复3次,记录各个重复的平均值。
1.2.4.1滤纸片杯法测不同浓度的大蒜汁对枯草芽孢杆菌和啤酒酵母的抑菌评价
取滤纸圆片,置于梯度大蒜汁(100%、50%、25%、12.5%、6.25%、3.13%、1.57%)中浸泡10 min,采用1.2.4滤纸片法测不同浓度的大蒜汁抑菌效果。
1.2.4.2滤纸片法测不同pH大蒜汁对枯草芽孢杆菌和啤酒酵母的抑菌评价
移取pH为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的磷酸缓冲液,与制备的大蒜汁混合,使所制备的大蒜汁终pH为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0,采用滤纸片法测定两种菌在不同pH下的抑菌圈大小。
1.2.5不同抑菌试验方法对苯甲酸钠、山梨酸钾防腐效果的影响
将苯甲酸钠、山梨酸钾分别调至最佳pH作用范围,苯甲酸钠pH2.5~4.0,在食品中的限量值为0.2 g/kg~1 g/kg,山梨酸钾pH5.0~6.0,在食品中的限量值0.2 g/kg~2 g/kg,分别采用牛津杯法和滤纸片法测定防腐剂对两种指示菌抑菌能力,并与大蒜汁抑菌效果进行比较。
2结果
2.1采用牛津杯法对大蒜汁抑菌效果评价
2.1.1牛津杯法测不同浓度的大蒜汁对枯草芽孢杆菌和啤酒酵母的抑菌效果评价
如图1(A-1,B-1)所示,不同浓度大蒜汁对枯草芽孢杆菌和啤酒酵母的抑菌效果趋势相同,随着大蒜汁浓度的降低抑菌效果逐渐减弱。对枯草芽孢杆菌的抑菌效果,鲜榨蒜汁与7 d蒜汁在6.25%都有抑菌圈出现(A-1)。图A-2所示,鲜榨蒜汁的抑菌效果优于7 d蒜汁,100%鲜榨蒜汁抑菌圈直径高于同浓度7 d蒜汁,高出9.4%,50%鲜榨汁抑菌圈直径高于同浓度7 d蒜汁21.7%,25%鲜榨汁抑菌圈直径高于同浓度7 d蒜汁26.3%,、12.5%鲜榨汁抑菌圈直径高于同浓度7 d蒜汁13.3%,6.25%鲜榨汁抑菌效果与同浓度7 d蒜汁无显著性差异,表明4℃存贮7 d蒜汁仍有抑菌效果且7 d蒜汁在3.13%浓度下(A-1)出现了抑菌圈,这可能是由于大蒜素的产生需要和氧气充分接触,较长时间的存放使得低浓度蒜汁大蒜素含量增加,出现抑菌圈。
与牛津杯法测啤酒酵母的效果相似(B-1),鲜榨蒜汁抑制啤酒酵母效果优于存贮7 d蒜汁,100%鲜榨蒜汁抑菌圈直径高于同浓度7 d蒜汁高出12.5%,50%鲜榨汁抑菌圈直径高于同浓度7 d蒜汁16.7%,25%鲜榨汁与同浓度7 d蒜汁抑菌圈直径无显著性差异,但4℃贮存7 d蒜汁在1.57%浓度下有抑菌圈出现(图B-1)。
图1 牛津杯法测不同浓度的大蒜汁对指示菌抑菌效果Fig.1Oxford cup method measurement different concentration of the garlic juice for the indicator bacteria antimicrobial effection
2.1.2牛津杯法测不同pH大蒜汁对枯草芽孢杆菌和啤酒酵母的抑菌评价
采用牛津杯法测不同pH鲜榨和4℃贮存7 d蒜汁对枯草芽孢杆菌、啤酒酵母抑菌效果,如图2-A、图2-B所示,pH 2~7都有抑菌圈出现,表明大蒜汁在较宽的pH范围都有抑菌活性;图2-C所示,抑菌圈直径在pH 5~7时大蒜汁抑菌效果最佳这与文献[9,16]大蒜素在pH=6.5时具有最强的生物活性相近,同时进一步验证前人对大蒜汁中主要生物抑菌成分大蒜素在偏酸性(pH5~7)条件下较稳定的论断[17-18]。通过测定大蒜原汁的pH为5.6,大蒜汁抑菌的最佳pH范围5~7,这个范围与大蒜原汁的pH接近。
图2 牛津杯法测不同pH的100%大蒜汁对指示菌抑菌影响Fig.2Oxford cup method measurement different PH of the100%garlic juice for the indicator bacteria antimicrobial effect
2.2采用滤纸片法对大蒜汁抑菌效果评价
2.2.1滤纸片法测不同浓度的大蒜汁对枯草芽孢杆菌和啤酒酵母的抑菌评价
如图3(A-1,B-1)所示,不同浓度大蒜汁对枯草芽孢杆菌和啤酒酵母的抑菌效果不同,大蒜汁浓度越大,抑菌效果越明显,鲜榨蒜汁抑菌圈直径高于同浓度7 d蒜汁。对枯草芽孢杆菌抑菌效果,100%鲜榨蒜汁高出7 d蒜汁22.2%,50%鲜榨汁抑菌圈直径高于同浓度7d蒜汁4.5%,25%鲜榨蒜汁高于同浓度7d蒜汁5.9%,12.5%无显著性差异,在6.25%浓度下4℃存贮7 d蒜汁仍有抑菌效果而鲜榨蒜汁无抑菌效果。
滤纸片法测啤酒酵母抑菌效果,鲜榨蒜汁抑制啤酒酵母效果与存贮7 d蒜汁抑菌效果相同,100%鲜榨蒜汁抑菌圈直径高于同浓度7 d蒜汁,高出7.1%,50%7 d蒜汁抑菌圈直径高于同浓度鲜榨汁8.9%,25%7 d蒜汁高于鲜榨汁抑菌圈直径3.3%,且4℃贮存7 d蒜汁在1.57%浓度下有抑菌圈出现(图3-B-1)。这可能是由于大蒜素的产生需要和氧气充分接触,较长时间的存放使得低浓度蒜汁大蒜素含量增加,出现抑菌圈。
图3 滤纸片法测不同浓度的大蒜汁对指示菌抑菌效果Fig.3Filter paper method measurement different concentration of the garlic juice for the indicator bacteria antimicrobial effection
2.2.2滤纸片法测不同pH大蒜汁对枯草芽孢杆菌和啤酒酵母的抑菌评价
如图4-A、图4-B所示,采用滤纸片法测鲜榨蒜汁和4℃贮存7d蒜汁在不同pH下抑菌效果,pH2~7时都有抑菌圈出现,表明大蒜汁在较宽的pH范围都有抑菌活性,通过图4-C抑菌圈直径不论是鲜榨蒜汁还是7d存贮蒜汁对指示菌在pH5~6时大蒜汁抑菌效果最佳,这与2.1.2牛津杯法测不同pH大蒜汁的抑菌谱(pH5~7)比较窄,表明不同的抑菌方法对结果的产生有较大影响。
2.3两种方法对指示菌抑菌效果分析
分别采用牛津杯法和滤纸片法测不同存贮期不同浓度大蒜汁对指示菌的抑菌影响,由图5-A蒜汁对枯草芽孢杆菌的抑菌效果,牛津杯法评价效果明显优于滤纸片法,在6.25%下可以检测到抑菌圈(高于滤纸片检测限12.5%),检测7 d蒜汁对枯草芽孢杆菌的抑菌效果,牛津杯法效果评价明显优于滤纸片法,在3.13%下可以检测到抑菌圈(高于滤纸片检测限6.25%);图5-B蒜汁对啤酒酵母的抑菌效果,牛津杯法与滤纸片法检测限一致,鲜榨汁液在3.13%下可以检测到抑菌圈,测7 d蒜汁牛津杯法与滤纸片法检测限一致,在1.57%下可以检测到抑菌圈。表明当指示菌是细菌时,采用牛津杯法能较好地体现抑菌作用;当指示菌为酵母菌时,采用牛津杯法和滤纸片法效果一致。这可能是因为滤纸片中大蒜汁暴露在纸片表面,加之枯草芽孢杆菌培养温度37℃使得大蒜抑菌物质随水分有所挥发,造成灵敏度偏低,这与刘春云等[19]的研究结果相似。另大蒜汁抑菌效果啤酒酵母强与枯草芽孢杆菌,100%鲜榨蒜汁对啤酒酵母抑菌效果高于枯草芽孢杆菌28.6%(图5),这与微生物细胞壁的结构有一定的相关性,G+细菌细胞壁结构致密,使得蒜汁抑制杀灭该菌较为困难。
图4 滤纸片法测不同pH的100%大蒜汁对指示菌抑菌影响Fig.4Filter paper method measurement different PH of the100% garlic juice for the indicator bacteria antimicrobial effect
图5 两种方法对指示菌抑菌效果影响Fig.5Two kinds of methods effect of the indicator bacteria antimicrobial effect
2.4与苯甲酸钠、山梨酸钾防腐效果对比
苯甲酸钠pH2.5~4.0,在食品中的限量值为0.2 g/kg~1g/kg,山梨酸钾pH5.0~6.0,在食品中的限量值0.2g/kg~2 g/kg,扩大食品中最高限量值10倍、100倍观察抑菌效果,显示不同抑菌试验方法对防腐剂防腐效果的影响,在适宜pH 1/10浓度的苯甲酸钠对指示菌有抑菌作用(高于最高限量100倍),1/10浓度的山梨酸钾有抑菌效果高于最高限量50倍且只对啤酒酵母有抑菌作用。通过表1抑菌圈直径比较,采用牛津杯法评价对枯草芽孢杆菌效果优于滤纸片法,当指示菌为酵母菌时,采用牛津杯法和滤纸片法灵敏度无显著差异。这与2.3评价两种方法对大蒜汁抑菌效果的影响是一致的。
图6 两种方法对指示菌抑菌效果评价Fig.6Two kinds of methods evaluated theeffect of the index bacteria
3讨论
在本研究中我们采用牛津杯、滤纸片两种方法来评价大蒜汁对番茄酱中常见腐败微生物枯草芽孢杆菌、啤酒酵母的抑菌效果影响。将大蒜榨汁后发现汁液有一定的抑菌效果且随着浓度增大抑菌效果增强,大蒜抑菌最佳pH为5~6,值得一提的是研究中发现不仅鲜榨蒜汁有抑菌活性,存贮7 d蒜汁仍有抑菌效果并在较低浓度下有抑菌效果。表明:1)通过直接取汁方式,可以保存大蒜中的主要抑菌物质——大蒜素,有期望将大蒜鲜榨汁作为天然防腐剂添加到食品中既能起到防腐保鲜作用又能增加产品风味,对原料充分使用,提高其经济价值,解决大蒜素天然活性提取成本高、浪费大且易损失易改变的缺点。2)与防腐剂苯甲酸钠、山梨酸钾抑菌效果对比,大蒜汁具有较强抑菌效果,3.13%蒜汁有抑菌效果,而防腐剂超标使用100倍才有抑菌效果。3)不论对蒜汁抑菌效果评价还是化学防腐剂抑菌效果评价,对枯草芽孢杆菌抑菌效果牛津杯法优于滤纸片法,尽管牛津杯在使用中容易发生由于操作不当,在放置中力度难以掌握,造成牛津杯在培养基表面滑动,对操作者操作手法要求较高,但通过牛津杯可以使抑菌物质均匀缓慢地分布渗透到平板中,所得抑菌圈规则清晰便于测量,这点在防腐剂的抑菌检测结果一致,通过牛津杯法,1/10浓度的苯甲酸钠对枯草芽孢杆菌有抑菌圈出现,但采用滤纸片法却检测不到,对啤酒酵母抑菌效果两种方法无显著差异。可见不同的抑菌试验方法对防腐剂效果的评价有明显影响,选择科学合理的评价方法对天然防腐物质的开发和准确评价具有重要作用。当指示菌为细菌时,采用牛津杯法,当指示菌为酵母菌时,可以采用滤纸片法进行评价。
表1 两种抑菌方法测定不同质量浓度防腐剂溶液抑菌效果(±s,n=3)Table 1Two kinds of antibacterial methods determination different oncentration preservative antimicrobial effect(±s,n=3)
表1 两种抑菌方法测定不同质量浓度防腐剂溶液抑菌效果(±s,n=3)Table 1Two kinds of antibacterial methods determination different oncentration preservative antimicrobial effect(±s,n=3)
注:“—”表示无抑菌圈。
平均抑菌圈直径/cm牛津杯法滤纸片法枯草芽孢杆菌啤酒酵母枯草芽孢杆菌啤酒酵母苯甲酸钠1/101.6±0.173.7±0.20—3.4±0.23苯甲酸钠1/100——苯甲酸钠1/1000——山梨酸钾1/10—3.9±0.22—3.7±0.25山梨酸钾1/100——山梨酸钾1/1000——质量浓度/(g/L)
大蒜作为良好的天然食品防腐剂,具有良好的抑制和杀灭微生物的作用,本试验通过榨汁方式,采用牛津杯法和滤纸片法取得了一定进展,但在试验中,1)大蒜汁贮藏期时间选择了鲜榨和7 d 2个时间段,还有待研究榨汁存贮时间更长的抑菌效果变化;2)受试菌株较少,仅选择了枯草芽孢杆菌和啤酒酵母两个指示菌,后期试验需加大供试菌株。3)除了定性测定生物抑菌活性的方法、牛津杯法和滤纸片法外,还有定量法、活菌计数和酶标比浊法,后期试验需做该两法的对比评价,将定量与定性相结合,全面、准确反映抑菌活性,这对天然防腐剂的开发和评价具有重要意义。
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Two Kinds of Antibacterial Effect of Garlic Juice Detection Technology Comparison and Evaluation
XIA Jun-fang1,YANG Ting1,ZHANG Zhen-zhen1,WU Yun1,GU Linazi1,ZHOU Mi2,FANG Dan2,LIU Qing3,*
(1.College of Food Science and Pharmacy,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,Xinjiang,China;2.Institute of Science and Technology,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,Xinjiang,China;3.School of Medical Instrument and Food Engineering,University of Shanghai for Science and Technology,Shanghai 200093,China)
Antibacterial ability is an important index to evaluate the effect of food preservatives,different experimental method evaluation the antibacterial ability of food preservatives will have a great influence,therefore,using Bacillus subtilis and Saccharomyces cerevisiae as the tested strains respectively use Oxford cup method and filter paper method to the fresh garlic juice and 4℃storage 7 days garlic juice bacteriostasis effect evaluate,for the antimicrobial properties of garlic juice were studied,for garlic juice biological antibacterial and preservative,provide experimental technique of a scientific theoretical basis and technological parameters,for the accurate evaluation of antibacterial effect provides a scientific and reasonable evaluation.
fresh garlic juice;the diameter of inhibition zone;oxford cup method;filter paper method
10.3969/j.issn.1005-6521.2015.16.039
2015-05-25
新疆农业大学大学生创新项目(201510758223)
夏俊芳(1986—),女(汉),助教,硕士,主要从事食品微生物安全控制研究。
刘箐(1970—),男(汉),教授,博士,主要从事食源性致病菌致病机理及快速检测技术研究。