肺动脉高压防治机制探讨

河南省商丘医学高等专科学校 (商丘 476000)　张　涛　王恩漫　王群让

常凤军▲



肺动脉高压防治机制探讨

河南省商丘医学高等专科学校 (商丘 476000)张涛王恩漫王群让△

常凤军▲

目的：研究大鼠肺高压(PH)模型体内循环微粒(MPs)的改变及左旋精氨酸(L-Arg)对MPs的影响，探讨肺动脉高压的防治机制。方法：取18只SD雄性大鼠随机分为三组(n=6)：对照组(C组)、MCT组(M组)L-Arg/MCT组(L组)。C组不做处理，通过腹腔注射野百合碱诱导M组和L组大鼠PH模型，随后L组大鼠每日注射L-Arg，C组和M组每日注射等量的生理盐水共3周。3周时测大鼠右心室压力、取血提取MPs、检测MPs含量及MPs对大鼠肺血管舒张功能的影响。结果：M组和L组的MPs含量较C组均升高(P<0.05)，且L组MPs含量较M组低(P<0.05)；M组和L组MPs对血管舒张功能的影响无显著性差异(P>0.05)。结论：L-Arg通过减少肺高压大鼠体内的MPs的含量而不是MPs的质量来改善肺高压，进一步阐明了L-Arg 防治PH的分子机制。

肺高压(Pulmonary hypertension, PH)严重危害了人民的健康，而且目前治疗肺高压的药物价格不菲，这给患者带来了沉重的经济负担。以往我们[1]及其他学者[2,3]的研究发现：左旋精氨酸(L-Arg)可以改善内皮功能进而缓解PH；循环微粒(MPs)通过以下途径加重PH：降低肺血管内皮一氧化氮合酶(eNOS)和增加弹性蛋白表达；损害肺血管舒张功能。鉴于L-Arg与MPs对PH影响的交叉，我们将研究L-Arg 是否可以影响MPs对肺血管舒张功能的影响而缓解PH，以便进一步了解L-Arg防治PH的分子机制。

材料与方法

1 动物与试剂 18只雄性SD大鼠，体重约200±10g，均购自陕西中医药大学附属医院动物实验中心。野百合碱 (Monocrotaline, MCT, sigma- aldrich，USA)，L-Arg (Sigma- Aldrich，USA)，K-H液试剂均为国产分析纯，均购自国奥生物科技有限公司；戊巴比妥钠(Sigma-Aldrich, USA)；RPMI 1640培养基(Gibico, USA)；BCA试剂盒(Thermo Scientific，USA)；重酒石酸去甲肾上腺素(Noradrenaline, Bitartrate, NA)，氯化乙酰胆碱(Acetylcholine chloride, Ach)，N -硝基-L-精氨酸甲酯(N- nitro-L-arginine methyl ester, L-NAME)购自Sigma-Aldrich。

2实验仪器 MD 2 000生物信号采集系统购买自南京医科大学，BI -420E+生物机能试验系统购自成都泰盟科技有限公司，EDTA抗凝管、注射器购自BD，高速离心机购自Beckman coulter。

3建模及分组 PH模型按文献制备[4]：生理盐水和乙醇(2∶8)混合液溶解MCT为20 g/L的溶液，将L-Arg用生理盐水配成150 g/L的溶液。18只大鼠随机分为三组(n=6)：对照组(C组)、MCT组(M组)、 L-Arg/ MCT组(L组)。C组不做处理，M组和L组大鼠腹腔注射MCT 50 mg/kg诱导PH，之后L组每日腹腔注射L-Arg(500mg/kg)，C组和M组每日注射等量的生理盐水共3周。

4检测方法

4.1 肺动脉压力测定: 3周结束时，戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉大鼠，BL-420E 生物机能试验系统检测右心室收缩压(Right ventricular systolic pressure，RVSP)[3]以间接反应肺动脉压力。

4.2 测定MPs： 肺动脉压力测定结束后采腹主动脉血，参照文献提取MPs[5]：首先离心(4℃ 11000g 2min)得到缺乏血小板血浆，然后取2ml缺乏血小板血浆再次离心(4℃ 13000g 45min)，弃去上清，用100ul RPMI 1640培养基重悬沉于管底的MPs。BCA试剂盒测定MPs蛋白浓度。

4.3 舒张功能：开胸取大鼠肺动脉，小心去除动脉周围组织，将动脉剪为3～4 mm的血管段并移入预先通气、(37±0.5)℃的K-H液(KH2PO41.2 mmol/L、MgSO41.2 mmol/L、CaCl22.5 m mol/L、glucose 11.0 mmol/L 、NaCl 118.0 mmol/L、KCl 4.7 mmol/L、NaHCO325.0 mmol/L)的浴皿中，调节MD 2 000生物信号采集系统。恒温通气，维持2g前负荷并让血管环平衡1h，期间每15 min换1次K-H液。平衡结束后，加KEL(终浓度10-6mol/L)收缩3次，检测血管环稳定性。然后后进行以下检测：用MPs(1 mg/ml)刺激血管环30min后用NA(终浓度10-6mol/L)收缩血管环(Vmax)，然后用Ach(终浓度10-7～10-4mol/L)舒张血管并记录相应张力值(Vach)，计算舒张率：(Vmax-Vach)/ Vmax。洗脱药物后用L-NAME (100μmol/L)孵育血管环30 min，重复用NA和ACh处理血管环以检测内皮依赖的血管舒张功能的变化。

结　果

1 三组大鼠RVSP比较M组为25.42±2.37 mmHg，较对照组(10.33±2.15 mmHg)明显升高(P<0.05)，提示PH建模成功；L组的17.89±2.37 mmHg，较M组低有所减低，说明L-Arg可以缓解PH病情。

2三组大鼠MPs检测结果比较见附表。 M组大鼠体内MPs含量较对照组明显升高(P<0.05)，L-Arg减少一部分MPs的产生(L组)。

3三组大鼠血管舒张功能检测结果比较见图1～2。对照组血管舒张率为(90.7±3.43)%，M组为(40.63±8.32)%，提示MPs明显抑制了肺血管的舒张功能。L-Arg(L组)组血管舒张率为(43.24±6.52)%，提示L-Arg并没有缓解MPs对大鼠肺血管舒张功能的损害。

图1　乙酰胆碱对血管舒张率的影响

图2 MPs对大鼠肺血管舒张功能的影响( *与对照组比较，P<0.05)

附表　 三组大鼠

注：*与C组比较，P<0.05；#与M组比较，P<0.05

讨　论

PH的病理机制复杂，多种内因子参与了PH的发生和发展，PH的肺血管阻力进行性增加，肺血管发生增殖及重塑[6]。一氧化氮(Nitric oxide，NO)是主要的血管内皮舒张因子。L-Arg作为内皮细胞合成NO的底物可以促进血管舒张，维持肺动脉压力保持在正常水平。以往的研究显示[1]：L-Arg可以上调eNOS蛋白的表达、抑制血小板的聚集、减少内皮素-1的产生、促进血管舒张而缓解PH。

MPs是在内皮细胞激活、发生凋亡时向周围的环境中分泌的大小约0.1～1 Lm，是亚微米级的细胞颗粒[7]。Hugel B 和Wang JM研究发现体内MPs含量反映内皮损伤和功能障碍[4,7]。我们曾发现[3]：MPs可以减少二尖瓣内皮细胞中eNOS蛋白的表达并减少NO的产生。王旭兰也发现[2]: MPs通过抑制肺血管中eNOS蛋白表达和上调弹性蛋白而加重肺高压病情。鉴于MPs与L-Arg在肺高压作用上有很多交叉之处，我们这次研究的假设就是：L-Arg是否是直接或间接通过作用于MPs而实现缓解肺高压的。

本研究发现：L-Arg部分减少了PH大鼠体内增高的MPs，但是并没有改善MPs对体外肺血管舒张功能的抑制作用。即：L-Arg通过为肺血管内皮细胞提供NO底物改善肺动脉压力，进而减少MPs的含量和缓解MPs对肺高压的加重，但是L-Arg并没有改变MPs的质量(L-Arg没有缓解M组大鼠体内MPs对离体肺血管舒张功能的抑制：L-Arg→PH↓→MPs含量↓(质量不变)→PH↓的循环)。我们的研究进一步阐明了L-Arg防治PH的机制，为今后寻求更好的防治PH的药物提供理论依据。

[1] 常凤军，魏伟，欧志君，等. 左旋精氨酸恢复eNOS和iNOS平衡并制肺动脉高压的研究[J].中华胸心血管外科杂志,2012，28(4):237-240.

[2] 王旭兰. 循环微粒对大鼠肺动脉内皮的损害及与肺动脉高压的关系[J].陕西医学杂志,2015,44(1):12-14.[3] Ci HB, Ou ZJ, Chang FJ,etal. Endothelial microparticles increase in mitral valve disease and impair mitral valve endothelial function[J]. American Journal of Physiology- Endocrinology and Metabolism,2013,304(7): 695- 702.

[4] Hugel B, Carmen M, Martinez MC,etal. Membrane microparticles: two sides of the coin[J].Physiology,2005,20(1): 22-27.

[5] 王妍,陶军,涂 昌,等. 高血压病对内皮微颗粒水平的影响[J].中华老年心脑血管病杂志, 2006, 8(4): 222- 224.

[6] Grimminger F, Schermuly RT. PDGF receptor and its antagonists: role in treatment of PAH[J].Adv Exp Med Biol,2010,661(6):435-46.

[7] Boulanger CM, Amabile N, Guerin AP,etal. In vivo shear stress determines circulating levels of endothelial microparticles in end-stage renal disease[J].Hypertension,2007,49(4): 902-908.

(收稿：2015-03-20)

陕西省人民医院心脏外科

R544.1

Adoi：10.3969/j.issn.1000-7377.2015.09.005

△陕西中医药大学附属医院心内科

主题词 高血压，肺性/药物疗法精氨酸/治疗应用模型，动物大鼠