糖尿病大鼠海马组织自噬减少与SIRT2下调有关

赵 攀庹 磊徐 洁陈思其徐 东詹 琳袁新初袁 琼*

（1 武汉科技大学医学院药学系，湖北 武汉430081；2 武汉科技大学医学院组织胚胎学教研室，湖北 武汉 430081）

糖尿病大鼠海马组织自噬减少与SIRT2下调有关

赵 攀1庹 磊1徐 洁1陈思其1徐 东1詹 琳1袁新初2袁 琼1*

（1 武汉科技大学医学院药学系，湖北 武汉430081；2 武汉科技大学医学院组织胚胎学教研室，湖北 武汉 430081）

目的 探讨自噬与SIRT2在糖尿病大鼠海马组织中的表达及意义。方法 采用单次腹腔注射链脲佐菌素（STZ，60 mg/kg）建立1型糖尿病大鼠（T1DM）模型，采用激光共聚焦检测LC3蛋白表达，采用免疫组化检测海马SIRT2蛋白表达水平。结果 与正常组相比，T1DM大鼠海马组织自噬减少，SIRT2表达降低，而胰岛素[4 U/（kg•d）]治疗后促进细胞自噬并上调SIRT2表达。结论 高血糖下调海马神经元SIRT2表达并抑制自噬发生，这可能与糖尿病脑病的发生与发展相关。

糖尿病脑病；SIRT2；自噬；高血糖；LC3

糖尿病脑病是糖尿病主要并发症之一。它主要是以电生理改变和中枢神经系统结构改变为特点[1-2]。慢性高血糖引起的糖尿病脑病是认知功能障碍的主要危险因子之一[3-5]。

自噬是维持系统稳态的不可缺少的分解代谢过程。它通过用双膜结构的自噬体清除受损的细胞器或者有缺陷的蛋白，并通过溶酶体降解并以此对环境变化做出反应[6]。很多研究人员已经证实诱导自噬与中枢神经系统疾病例如阿尔茨海默病相关。然而那，研究人员最近在发生AD的临床前期阶段研究发现淀粉样蛋白（Aβ）（1-42）水平明显升高，而自噬现象减少[7]。至今，没有证据证实自噬和糖尿病脑病之间的相关性。在本实验中我们将证实糖尿病脑病与自噬间的相关性。

SIRT2属于高保守的NAD+-依赖性去乙酰化酶家族，该家族有7中亚型分别为SIRT1-SIRT7，这其中亚型定位于不同的亚细胞器，而他们的底物包括了组蛋白和转录因子以及酶类[8-9]。敲除SIRT2表达能增加自噬并不正常的延长微管抑制剂引起的细胞有丝分裂阻滞[10]，过度SIRT2能抑制溶酶体介导自噬体的形成[11]，异常蛋白聚集被认为是许多神经退行性疾病的共同病理过程[12]。SIRT2能通过抑制蛋白酶干扰神经细胞自噬降解聚集蛋白的功能。因此，我们推测SIRT2能通过调节自噬介导糖尿病脑病的发生。本研究采用1糖尿病大鼠模型来研究在糖尿病脑病发展过程中SIRT2表达与自噬的相关性。

1　方法与材料

1.1实验动物、主要药物、试剂：SD大鼠30只，雄性，体质量180～200 g，由武汉大学实验动物中心提供。链脲佐菌素（STZ）购于美国Sigma公司，蛋白抽提试剂盒购于北京博奥森生物公司，LC-3、SIRT2、辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗均购于美国Santa Cruze公司，S-P试剂盒及DAB显色试剂盒购于北京中杉金桥生物有限公司，DMR+Q550病理图像分析仪购于德国莱卡公司。

1.21型糖尿病大鼠模型建立和分组：链脲佐菌素（STZ）（Sigma-Aldrich，MO，USA）溶于0.1 mol/L pH=4.3的枸橼酸钠缓冲液。SD大鼠环境适应1周后，通过腹腔注射的STZ（65 mg/kg）。空白对照组腹腔注射与STZ剂量相同的枸橼酸钠缓冲液。在72 h后，测量空腹血糖，血糖水平高于11.1 mmol/L模型建立成功。体质量和血糖水平在实验结束时测定。大鼠分成以下3组（每组6～9只）：①空白对照组：无糖尿病；②1型糖尿病组；③1型糖尿病组+胰岛素[按4 U/（kg•d）]进行皮下注射胰岛素）。糖尿病模型建立12周后，收集样本，检测相应指标。

1.3免疫组织化学SP法检测蛋白表达：造模结束后处死大鼠，取脑组织海马部位，用4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋、切片，采用SP法严格按照说明书操作检测SIRT2蛋白表达，SIRT2一抗稀释度为1∶200，柠檬酸抗原热修复，DAB显色，PBS代替一抗做阴性对照。在图像分析仪上，SIRT2阳性细胞的平均百分比是从六个领域的海马组织切片用光镜观察计算（400×放大）。

1.4激光共聚焦检测LC3蛋白表达：脱蜡，血清封闭2 h，山羊抗大鼠LC3（1∶100）4 ℃孵育过夜，PBS洗涤3次，FITC-抗山羊二抗37 ℃孵育1 h，PBS洗涤，DAPI染液孵育10 min，缓冲甘油封片，置于激光共聚焦显微镜（日本）进行扫描分析。

1.5统计分析：所有数据均用（x-±s）EM表示。组间差异采用Oneway ANOVA和Student-Newman-Keuls多重比较检验分析。双侧P<0.05认为差异有统计学意义。

2　结果

2.11型糖尿病大鼠代谢异常：见表1所示，与正常对照组相比，1型糖尿病大鼠体质量（225.7±23）g显著减轻，血糖水平（23.2±1.3）mmol/L升高，糖化血红蛋白水平（11.9±1.4）%升高。而胰岛素治疗组，1型糖尿病大鼠的代谢特征包括体质量，血糖水平，糖化血红蛋白参数均与空白对照组的大鼠相似。

表1　1型糖尿病大鼠体质量、血糖和糖化血红蛋白水平

2.2高血糖症对糖尿病大鼠海马神经细胞自噬的影响：LC3是自噬的标记蛋白，本实验采用激光共聚焦检测该蛋白表达水平。见图1所示，与正常对照组相比，1型糖尿病大鼠海马神经细胞核周点状的LC3蛋白表达下调，而胰岛素治疗后，在海马中LC3的表达得到调整。这些结果表明高血糖在糖尿病脑病初期抑制细胞自噬。

图1　激光共聚焦检测糖尿病脑病大鼠海马LC3表达

2.3高血糖症对糖尿病大鼠海马神经细胞SIRT2表达的影响：见图2A所示，1型糖尿病大鼠海马内SIRT2的免疫反应性降低，1型糖尿病脑病SIRT2的免疫组化得分（3.2±0.5）明显低于空白对照组的得分（6.3 ±0.6；P<0.01，图2B）。用胰岛素治疗进行逆转治疗明显反转了高血糖对SIRT2表达的影响（5.8±0.5， P<0.01；图2）。

图2　免疫组化检测海马SIRT2蛋白表达。A：免疫组化代表性图片。棕色的颗粒为染色阳性；B：SIRT2免疫组化评分统计图。n=6–7，**P<0.01vs. control；++P<0.01vs.T1DM

3　讨论

自噬是一种维持细胞环境稳态的降解过程，去除异常细胞成分起着重要的作用[13]。在自噬过程中，靶蛋白和细胞器被送入双层膜的自噬溶酶体内降解[14]。因此，在神经系统中的细胞自噬主要是维持细胞蛋白形成与降解之间的正常平衡，而抑制自噬通路与多种神经退行性疾如阿尔兹海默症[15]、帕金森病[16]相关。近来，研究证实抑制细胞自噬与β-淀粉样蛋白引起的神经元功能障碍有关。错误折叠的蛋白质进入线粒体，导致氧化磷酸化功能障碍[17]并阻断随后的自噬激活[18]。因此，自噬率降低能导致神经元β-淀粉样蛋白积累[19]。作为老年痴呆症的一个危险因素，高血糖能损害海马的功能并造成糖尿病的认知能力下降[20-21]。本研究中发现在1型糖尿病脑病的早期阶段，高血糖抑制脑海马组织神经元自噬，而降低血糖水平能逆转细胞自噬。这提示神经元细胞自噬功能受损导致异常蛋白聚集在细胞参与糖尿病脑病的发展。

SIRT2是sirtuin蛋白家族的一员，是一种胞质蛋白，能使靶蛋白脱乙酰基调节细胞有丝分裂。最近的研究表明，SIRT2可能参与自噬调控，在去除错误折叠蛋白、受损的细胞器和内生膜系统的激活和动员有重要的作用[11,22]。在应激反应中，FoxO1被SIRT2去乙酰化，而乙酰化的FoxO1能结合Atg7，促进自噬从而导致细胞死亡[23]。此外，在蛋白酶体的抑制作用下，干扰SIRT2表达能抑制自噬介导的神经元细胞中蛋白质聚集体的降解[11]。本研究结果显示1型糖尿病大鼠海马内SIRT2表达下调，胰岛素治疗组能上调糖尿病大鼠海马组织SIRT2蛋白表达。糖尿病脑病时，SIRT2的表达与自噬发生呈正相关。因此，我们推测高血糖能通过抑制海马神经元细胞SIRT2表达从而抑制自噬，使细胞内稳态发生变化导致无法对应激状态下产生的受损蛋白或者细胞器清除从而促进糖尿病脑病的发生。然而确切机制尚有待进一步探讨。

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Relationship of Autophagy and SIRT2 in the Hippocampus of T1DM Rats

ZHAO Pan1, TUO Lei1, XU Jie1, CHEN Si-qi1, XU Dong1, ZHAN Lin1, YUAN Xin-chu2, YUAN Qiong1*
(1 Department of Pharmacology, Medical College, Wuhan University of Science and Technology, Wuhan 430081, China; 2 Department of Histology and Embryology, Medical College, Wuhan University of Science and Technology, Wuhan 430065, China)

Objective To demenstrate the relationship of autophagy and SIRT2 in the hippocampus of type 1 diabetic mellitus(T1DM) rats. Methods The rat model of T1DM was established by intraperitoneal injection of streptozotocin(60 mg/kg) for one time. LC3 expression was detected by confocal analysis; SIRT2 expression was detected by immunohistochemistry. Results Compared with the normal rats, autophagy was inhibited in hippocampus of T1DM rats; the expression of SIRT2 was also downregulated.Treatment of insulin[4 U/(kg•d)] reverased the effect of hyperglycemia on autophagy and SIRT2 expression.

Diabetic encephalopathy; Autophagy; SIRT2; Hyperglycemia; LC3

R587.1

B

1671-8194（2015）36-0010-03

Conclusion The expression of SIRT2 downregulation may be involved in the inhibition of autophagy, which was associated with the progression and pathogenesis of diabetic encephalopathy.