烤鸭中金黄色葡萄球菌生长模型的建立

宇盛好，曹　慧，徐　斐，*，于劲松，袁　敏，彭少杰，王李伟，李　洁，王　颖

（1.上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093；2.上海市食品药品监督管理局执法总队，上海 200233）

烤鸭中金黄色葡萄球菌生长模型的建立

宇盛好1，曹慧1，徐斐1，*，于劲松1，袁敏1，彭少杰2，王李伟2，李洁2，王颖2

（1.上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093；2.上海市食品药品监督管理局执法总队，上海 200233）

选用修正的Gompertz（SGompertz）和修正的Logistic（Slogistic）作为一级生长模型，应用Origin 9.0软件分别拟合烤鸭中金黄色葡萄球菌在10、15、25、30、37 ℃的生长数据，并以此获得最大比生长速率（μmax）和迟滞期（λ）。在此基础上，采用平方根模型和二次多项式模型建立二级生长模型。结果表明，SGompertz模型拟合的R2值优于Slogistic模型。以SGompertz模型拟合得到的μmax建立平方根和二次多项式模型R2分别为0.942 3、0.947 1，偏差因子（Bf）分别为1.02和0.93，准确因子（Af）分别为1.18和1.37，表明采用μmax进行拟合时平方根模型的预测效果较好；以SGompertz模型拟合得到的λ建立的平方根和二次多项式模型R2分别为0.953 3、0.987 1，Bf分别为0.99和1.00，Af分别为1.11和1.06，表明采用λ进行拟合时二次多项式模型较好。

金黄色葡萄球菌；烤鸭；一级生长模型；二级生长模型

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）在自然界中普遍存在［1］，其最适生长温度为30～37 ℃［2］，pH值为范围为4.5～9.3［3］。金黄色葡萄球菌的部分菌株可产生耐热的致病性肠毒素［4］，主要有SEA～SEE 5 种血清型［5-6］，近年来许多新的肠毒素血清型如SEG、SEH、SEI、SEJ、SEK、SEL、SEM、SEN、SEO、SEP、SEQ、SER和SEU被陆续发现［7-10］。在这些血清型中，其中由A型肠毒素引起食物中毒的现象较为常见［11-12］，当其摄入量达到0.1～1.0 μg时即可引起食物中毒［3，13］。在美国由金黄色葡萄球肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占45%［14］。营养丰富且含水量较高的食品较易污染金黄色葡萄球菌，如即食熟肉［15-18］、乳制品［19-20］、奶油蛋糕［21］等。烤鸭是我国食用最为普遍的即食熟肉产品，同时也是金黄色葡萄球菌的重要污染源［22］，然而对烤鸭中金黄色葡萄球菌生长预测模型研究较少，因而本研究选用SGompertz和Slogistic作为一级生长模型，应用Origin 9.0软件分别拟合烤鸭中金黄色葡萄球菌在10、15、25、30、37 ℃的生长数据，并以此获得μmax和λ。在此基础上，采用平方根模型和二次多项式模型建立二级生长模型，研究结果可为烤鸭的定量风险评估提供科学依据。

1　材料与方法

1.1材料、菌株与试剂

烤鸭，熟食店购买。

金黄色葡萄球菌株（ATCC6538），购于广东省微生物研究所。

Baird-Parker琼脂平板、亚碲酸钾卵黄增菌液、脑心浸出液肉汤（BHI）、无菌均质袋 青岛高科园海博生物技术有限公司；NaCl（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2仪器与设备

YXQ-LS-75SⅡ型立式压力蒸汽灭菌锅 上海博迅实业有限公司；SW-CJ-1FD型洁净工作台 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；HWS-150型恒温恒湿培养箱 上海比朗仪器有限公司；SCIENTZ-09无菌均质器 宁波新芝生物科技股份有限公司；BCD-226K50型冰箱 TCL集团股份有限公司。

1.3方法

1.3.1金黄色葡萄球菌的接种、培养及计数

将金黄色葡萄球菌接种到BHI营养液中，置于37 ℃的恒温恒湿培养箱中培养12 h，在600 nm波长处测定菌悬液的吸光度，用无菌生理盐水（8.5 g/L的NaCl溶液）梯度稀释菌悬液，使初始接种量控制在103CFU/g左右。按无菌操作，将烤鸭分为10 g/份，在紫外下灭菌30 min后装入无菌均质袋，吸取1 mL稀释过的菌悬液接种到上述无菌处理过的烤鸭之中，并分别置于10、15、25、30、37 ℃的恒温恒湿培养箱中分别培养190、120、32、32、30 h。每隔一定时间取出1 份试样加入90 mL无菌生理盐水，均质2 min后取均质液1 mL，稀释并按照GB4789.10—2010《食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》中的平板计数法测定菌落数。每个温度设3 组平行。不同温度下测定终止时间以金黄色葡萄球菌生长达到稳定期为准。以未接种金黄色葡萄球菌的烤鸭作为空白对照。

1.3.2烤鸭中金黄色葡萄球菌一级生长模型的建立

根据实验得到的烤鸭中金黄色葡萄球菌在不同温度下的生长数据，选择SGompertz模型［23］（公式（1））和Slogistic模型［23］（公式（2））为一级模型对烤鸭中金黄色葡萄球菌生长情况进行拟合。根据拟合得到的模型参数，SGompertz模型选用公式（3）计算出最大比生长速率（μmax，lg（CFU/g）/h）和公式（4）计算出迟滞期（λ）。Slogistic模型选用公式（5）计算出最大比生长速率（μmax）和公式（6）计算出迟滞期（λ）。

式中：Nt、N0分别表示在时间t时和初始时间的微生物数量/（CFU/g）；λ为迟滞期/h；a为最大菌数Nmax与初始菌数N0的对数值的差值（lg（CFU/g））；xc为达到相对最大生长速率所需的时间/h；k为在时间xc的相对生长速率/（（lg（CFU/g））/h）。

1.3.3烤鸭中金黄色葡萄球菌二级生长模型的建立

根据一级模型得到的烤鸭中金黄色葡萄球菌的最大比生长速率和迟滞期，选取平方根模型［24］（square root model）（公式（7）、（8））和二次多项式模型［25］（quadratic polynomial model）（公式（9））拟合其与温度之间的生长关系，表达式如下：

式中：T是实验中的生长温度/℃；Tmin是理论上金黄色葡萄球菌生长的最低温度/℃；a、b、c为模型的参数。

1.3.4模型的评价

采用均方误差（mean square error，MSE）（公式（10））和R2对一级模型进行评价。选择R2、MSE、偏差因子（bias factor，Bf）（公式（11））、准确因子（accuracy factor，Af）（公式（12））对二级模型进行评价［25-29］。

式中：n为实测值个数。

2　结果与分析

2.1烤鸭中金黄色葡萄球菌生长的一级模型

选用SGompertz和Slogistic模型，应用Origin 9.0软件分别拟合金黄色葡萄球菌在不同温度的生长曲线（图1～5），得到其模型拟合参数（表1）。结果表明，SGompertz模型能较好地拟合烤鸭中金黄色葡萄球菌在10、15、25、30、37 ℃的生长曲线，其R2值分别为0.996 7、0.994 8、0.995 3、0.991 0、0.998 7，均优于Slogistic模型的R2值，MSE值分别为0.010 8、0.018 3、0.015 8、0.032 3、0.004 8均小于Slogistic模型的MSE值。这表明SGompertz模型的拟合度较高，模型的误差较小，因此选择其作为金黄色葡萄球菌最适的一级生长模型。

图1　SGompertz模型（a）和Slogistic模型（b）拟合的烤鸭中金黄色葡萄球菌在10 ℃的生长曲线Fig.1　Growth curves of Staphylococcus aureus in roast duck at 10 ℃from SGompertz （a） and Slogistic models （b）

图2　SGompertz模型（a）和Slogistic模型（b）拟合的烤鸭中金黄色葡萄球菌在15 ℃的生长曲线Fig.2　Growth curves of Staphylococcus aureus in roast duck at 15 ℃from SGompertz （a） and Slogistic models （b）

图3　SGompertz模型（a）和Slogistic模型（b）拟合的烤鸭中金黄色葡萄球菌在25 ℃的生长曲线Fig.3　Growth curves of Staphylococcus aureus in roast duck at 25 ℃from SGompertz （a） and Slogistic models （b）

图4　SGompertz模型（a）和Slogistic模型（b）拟合的烤鸭中金黄色葡萄球菌在30 ℃的生长曲线Fig.4　Growth curves of Staphylococcus aureus in roast duck at 30 ℃from SGompertz （a） and Slogistic models （b）

图5　SGompertz模型（a）和Slogistic模型（b）拟合的烤鸭中金黄色葡萄球菌在37 ℃的生长曲线Fig.5　Growth curves of Staphylococcus aureus in roast duck at 37 ℃from SGompertz （a） and Slogistic models （b）

表1　烤鸭中金黄色葡萄球菌的一级生长模型拟合参数Table1　Fitting parameters for the primary growth model of Staphylococcus aureus reus in roast duck

根据SGompertz模型拟合的烤鸭中金黄色葡萄球菌在不同温度下的最适生长模型如表2所示，由此计算的最大比生长速率和迟滞期如表3所示。可见，随着温度的增加，金黄色葡萄球菌在烤鸭中的最大比生长速率呈增加的趋势，而迟滞期则呈降低的趋势。

表2　烤鸭中金黄色葡萄球菌的最适一级生长模型Table2　Optimal primary growth model of eus in roast duck

表3　SGompertz模型得到的不同温度条件下的生长参数Table3　Kinetic growth parameters estimated by SGompertz model at different temperatures ures

2.2烤鸭中金黄色葡萄球菌二级生长模型的建立

根据SGompertz模型拟合得到金黄色葡萄球菌在不同温度下的μmax和λ，选用平方根和二次多项式模型作为二级模型，采用Origin 9.0软件分别对温度与μmax、λ的关系进行拟合，结果如图6、7所示。

图6　平方根模型（a）和二次多项式模型（b）拟合的烤鸭中μmax与生长温度的关系曲线Fig.6　Maximum growth rates of Staphylococcus aureus at different temperatures fitted by square root model （a） and quadratic polynomial model （b）

图7　平方根模型（a）和二次多项式模型（b）拟合的烤鸭中λ与生长温度的关系曲线Fig.7　Lag time of Staphylococcus aureus at different temperatures fitted by square root model （a） and quadratic polynomial model （b）

由图6a可知，采用平方根模型拟合的温度与μmax关系的R2为0.942 3，采用二次多项式模型（图6b）拟合的R2为0.947 1。

由图7可知，采用平方根模型拟合的温度与λ关系的R2为0.953 3，采用二次多项式模型拟合的R2为0.987 1。可见选用的两种二级模型拟合度都较高。

2.3模型评价

Bf和Af被认为是验证模型可靠度的有效工具［28-29］。根据Ross对偏差因子的划分标准［26，30-31］，Bf在0.9～1.05之间，Bf越接近于1，模型越可靠；如果Bf值在0.70～0.90或者1.06～1.15范围之内，该模型也可以被接受。Af与Bf类似，其值越接近1，模型越可靠［26，29-31］。MSE则用来评价数据的变异程度，MSE值越小，说明预测模型精确度越好。因而，本研究采用MSE、Bf和Af对所建的平方根模型和二次多项式模型进行评价，结果如表4所示。

表4　二级模型的评价Table4　Various statistical characteristics of secondary models

由表4可知，在对金黄色葡萄球菌生长温度与μmax之间的关系进行拟合时，平方根模型的Bf为1.02，Af为1.18，表明该生长模型的预测值超出实测值2%（Bf＞1），预测误差为18%。二次多项式模型的Bf为0.93，Af为1.37，表明该生长预测模型的预测误差为37%。两种二级模的MSE值较小，均小于0.004。由于平方根模型的Bf和Af更接近于1，因此选择其预测烤鸭中金黄色葡萄球菌在10～37 ℃之间的生长。Kang等［31］采用修正Gompertz模型为一级模型，平方根模型为二级模型建立了不同温度下半干的秋刀鱼中金黄色葡萄球菌的最大比生长速率预测模型，该模型的Bf值为1.02，Af为1.17，可能的预测误差为17%，预测效果与本研究类似。

进一步对金黄色葡萄球菌生长温度与λ之间的关系进行拟合，可见平方根模型的Bf为0.99，Af为1.11，表明该生长预测模型的预测误差为11%。而二次多项式模型的Bf为1.00，Af为1.06，其预测误差仅为6%。同时，二次多项式模型的MSE值（0.081 3）也明显小于平方根模型的MSE值（0.402 3），因此选择其预测烤鸭中金黄色葡萄球菌在10～37 ℃之间生长的迟滞期。Park等［25］也采用修正的Gompertz模型为一级模型，二次多项式模型为二级模型建立了不同温度下煮菠菜中金黄色葡萄球菌的迟滞期预测模型，其Bf值为1.05，Af为1.19，可能的预测误差为19%，误差略高于本研究。Kang等［31］采用和本研究同样的模型建立了不同温度下半干的秋刀鱼中金黄色葡萄球菌的迟滞期预测模型时，该模型的Bf值为1.08，Af值为1.08，可能的预测误差为8%，预测效果与本研究类似。

3　结 论

SGompertz模型能较好地拟合烤鸭中金黄色葡萄球菌在10、15、25、30、37 ℃的生长曲线，其R2都在0.99以上，MSE值均小于0.04，因此选择其作为金黄色葡萄球菌最适的一级生长预测模型。在对金黄色葡萄球菌生长温度与其最大比生长速率之间的关系进行拟合时，平方根模型的Bf为1.02，Af为1.18，MSE值为0.003 7，因此选择其预测烤鸭中金黄色葡萄球菌在10～37 ℃之间的生长，相应的二级平方根模型为在对金黄色葡萄球菌生长温度与其迟滞期之间的关系进行拟合时，二次多项式模型的Bf为1.00，Af为1.06，MSE值为0.081 3，因此选择其预测烤鸭中金黄色葡萄球菌在10～37 ℃之间的生长迟滞期，相应的二次多项式模型为λ=0.015 0T2-1.037 2T+19.896 3。本实验结果可以对以后烤鸭等即食肉制品的危害分析与关键控制点（hazard analysis and critical control point，HACCP）和定量风险评估的暴露评估提供了科学依据。

［1］ 遇晓杰， 闫军， 苏华， 等. 原料乳中金黄色葡萄球菌的风险评估及防控策略的建立［J］. 中国乳品工业， 2010， 38（9）： 53-58.

［2］ SCHMITT M， SCHULER-SCHMID U， SCHMIDT-LORENZ W. Temperature limits of growth， TNase and enterotoxin production of Staphylococcus aureus strains isolated from foods［J］. International Journal of Food Microbiology， 1990， 11（1）： 1-19.

［3］ 骆漩. 上海市鲜猪肉中金黄色葡萄球菌定量风险评估［D］. 上海： 复旦大学， 2010： 23-24.

［4］ BALABAN N， RASOOLY A. Staphylococcal enterotoxins［J］. International Journal of Food Microbiology， 2000， 61（1）： 1-10.

［5］ K☒ROUANTON A， HENNEKINNE J A， LETERTRE C， et al. Characterization of Staphylococcus aureus strains associated with food poisoning outbreaks in France［J］. International Journal of Food Microbiology， 2007， 115（3）： 369-375.

［6］ ASAO T， KUMEDA Y， KAWAI T， et al. An extensive outbreak of staphylococcal food poisoning due to low-fat milk in Japan： estimation of enterotoxin A in the incriminated milk and powdered skim milk［J］. Epidemiology and Infection， 2003， 130（1）： 30-40.

［7］ ZHANG S， IANDOLO J J， STEWART G C. The enterotoxin D plasmid of Staphylococcus aureus encodes a second enterotoxin determinant（sej）［J］. FEMS Microbiology Letters， 1998， 168（2）： 227-233.

［8］ JARRAUD S， PEYRAT M A， LIM A， et al. Egc， a highly prevalent operon of enterotoxin gene， forms putative nursery of superantigens in Staphylococcus aureus［J］. Journal of Immunology， 2001， 166（1）： 669-677.

［9］ SCHERRER D， CORTI S， MUEHLHERR J E， et al. Phenotypic and genotypic characteristics of Staphylococcus aureus isolates from raw bulk-tank milk samples of goats and sheep［J］. Veterinary Microbiology， 2004， 101（2）： 101-107.

［10］ MORANDI S， BRASCA M， LODI R， et al. Detection of classical enterotoxins and identification of enterotoxin genes in Staphylococcus aureus from milk and dairy products［J］. Veterinary Microbiology，2007， 124（1/2）： 66-72.

［11］ 徐国进， 黄和. 单冻生虾仁中金黄色葡萄球菌的风险评估［J］. 现代食品科技， 2008， 24（4）： 375-377.

［12］ 巢国祥， 焦新安， 周丽萍， 等. 食源性金黄色葡萄球菌流行特征、产肠毒素特性及耐药性研究［J］. 中国卫生检验杂志， 2006， 16（8）：904-907.

［13］ RHO M J， SCHAFFNER D W. Microbial risk assessment of staphylococcal food poisoning in Korean kimbab［J］. International Journal of Food Microbiology， 2007， 116（3）： 332-338.

［14］ 李文杰， 黄和， 傅洪锐， 等. 模拟蟹肉中金黄色葡萄球菌生长模型的建立［J］. 食品与发酵工业， 2008， 34（12）： 10-12； 17.

［15］ CASTILLEJO-RODRIGUEZ A M， GIMENO R M G， COSANO G Z，et al. Assessment of mathematical models for predicting Staphylococcus aureus growth in cooked meat products［J］. Journal of Food Protection，2002， 65（4）： 659-665.

［16］ 高玉春， 巢国祥. 2005年扬州市食源性致病菌污染状况研究［J］. 江苏预防医学， 2006， 17（4）： 34-36.

［17］ 许振伟， 韩奕奕， 孟瑾， 等. 熟食肉制品中金黄色葡萄球菌风险评估基础研究［J］. 包装与食品机械， 2012， 30（5）： 40-43.

［18］ 刘伟， 王菊光， 谢利军， 等. 北京市海淀区2010—2012年直接入口食品食源性致病菌污染状况分析［J］. 现代预防医学， 2014， 41（8）：1391-1393.

［19］ 张丽. 不同食品中金黄色葡萄球菌的检出分析［J］. 中国中医药咨讯，2012， 4（1）： 143.

［20］ FUJIKAWA H， MOROZUMI S. Modeling Staphylococcus aureus growth and enterotoxin production in milk［J］. Food Microbiology，2006， 23（3）： 260-267.

［21］ OH S K， LEE N R， CHO Y S， et al. Occurrence of toxigenic Staphylococcus aureus in ready-to-eat food in Korea［J］. Journal of Food Protection， 2007， 70（5）： 1153-1158.

［22］ 雷云瑞， 柴文平， 解立满， 等. 廊坊市食品中金黄色葡萄球菌的检测及污染状况分析［J］. 食品与发酵科技， 2010， 46（1）： 100-104.

［23］ GIBSON A M， BRATCHELL N， ROBERTS T A. The effect of sodium chloride and temperature on the rate and extend of growth of Clostridium botulinum type A in pasteurized pork slurry［J］. Journal of Applied Bacteriology， 1987， 62（6）： 479-490.

［24］ RATKOWSKY D A， OLLEY J， MCMEEKIN T A， et al. Relationship between temperature and growth rates of bacterial cultures［J］. Journal of Bacteriology， 1982， 149（1）： 1-5.

［25］ PARK H S， SUNG B Y， RYU K. Predictive model for growth of Staphylococcus aureus in blanched spinach with seasoning［J］. Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry， 2012， 55（4）：529-533.

［26］ ROSS T. Indices for performance evaluation of predictive model in food microbiology［J］. Journal of Applied Microbiology， 1996， 81（5）：501-508.

［27］ 董庆利， 高翠， 丁甜， 等. 冷却猪肉中气单胞菌生长预测模型的建立和检验［J］. 生物加工过程， 2012， 10（2）： 50-54.

［28］ TE-GIFFEL M C， ZWIETERING M H. Validation of predictive models describing the growth of Listeria monocytogenes［J］. International Journal of Food Microbiology， 1999， 46（2）： 135-149.

［29］ 张引成， 尹晓婷， 雷云， 等. 鲜切结球莴苣中单增李斯特菌生长预测模型的建立［J］. 食品与发酵工业， 2013， 39（7）： 30-34.

［30］ ROSS T， DALGAARD P， TIENUNGOON S. Predictive modeling of the growth and survival of Listeria in fishery products［J］. International Journal of Food Microbiology， 2000， 62（3）： 231-245.

［31］ KANG H S， HA S D， JEONG S W， et al. Predictive modeling of Staphylococcus aureus growth on Gwamegi （semidry Pacific saury） as a function of temperature［J］. Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry， 2013， 56（6）： 731-738.

Predictive Models for the Growth of Staphylococcus aureus in Roast Duck

YU Shenghao1， CAO Hui1， XU Fei1，*， YU Jinsong1， YUAN Min1， PENG Shaojie2， WANG Liwei2， LI Jie2， WANG Ying2
（1. School of Medical Instrument and Food Engineering， University of Shanghai for Science and Technology， Shanghai 200093， China；2. Law Enforcement Corps of Shanghai Food and Drug Administration Bureau， Shanghai 200233， China）

Modified Gompertz （SGompertz） and logistic （Slogistic） models were selected as the primary growth models to fit the growth curves of Staphylococcus aureus in roast duck at various storage temperatures （10， 15， 25， 30 and 37 ℃）. Using the obtained specific growth rate （μmax） and lag time （λ）， square root model and quadratic polynomial model were selected to fit the secondary growth models of Staphylococcus aureus in roast duck. The results showed that the SGompertz model could well describe the growth of Staphylococcus aureus at different temperatures， and therefore μmaxand λ values obtained from it were used to establish the secondary growth models. It was found that for the square root and quadratic polynomial models based on μmax， R2values were 0.942 3 and 0.947 1； Bfwere 1.02 and 0.93； Afwere 1.18 and 1.37， respectively， suggesting that the square root model could be employed to predict the growth of Staphylococcus aureus in roast duck. For the square root and quadratic polynomial models describing λ， R2were 0.953 3 and 0.987 1； Bfwere 0.99 and 1.00； Afwere 1.11 and 1.06，respectively， suggesting that the quadratic polynomial model could be employed to predict λ. This study can provide basic information for quantitative microbial risk assessment of roast duck and other ready-to-eat cooked meat products.

Staphylococcus aureus； roast duck； primary growth model； secondary growth model

TS201.3

A

1002-6630（2015）13-0154-06

10.7506/spkx1002-6630-201513029

2014-09-09

上海市科委重点攻关项目（11391902000；13391901400）

宇盛好（1990—），男，硕士研究生，研究方向为食品安全风险评估。E-mail：850368049@qq.com

徐斐（1972—），女，教授，博士，研究方向为食品安全风险评估。E-mail：xufei.first@263.net