浙江省“浙八味”道地药材真菌病害调查及病原鉴定

钱永生　蔡苏　吴剑丙等

摘要：通过对浙江省磐安地区“浙八味”药材真菌病害进行病原菌分离和鉴定，采用无菌培养基平板分离技术，从药材植物病叶中分离获得病原真菌，构建真菌ITS系统发育树，对病原菌进行分子水平的分类鉴定，并观察病原菌菌落形态及显微结构和形态学鉴定共获得9种病原真菌，分别为链格孢菌（Alternaria sp.）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、球毛壳菌（Chaetomium globosum）、绿色木霉菌（Hypocrea virens）、月状旋孢腔菌（Cochliobolus lunatus）、球孢黑孢霉（Nigrospora sphaerica）、木贼镰刀菌（Fusarium equiseti）、束状刺盘孢（Colletotrichum dematium）和茎点霉菌（Phoma sp.）。查阅药用植物病原菌记录并结合科赫法则实验，当地药用植物成为3种病原菌的新寄主，分别为月状旋孢腔菌引起的安徽亳州白芍褐斑病、束状刺盘孢引起的磐安阔叶麦冬炭疽病、球毛壳菌引起的早小洋菊叶枯病。

关键词：“浙八味”； 中药材； 病原真菌； ITS； 鉴定

中图分类号：S432 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）19-4740-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.19.021

Abstract： The pathogen species and infection status in trueborn “Zhe-ba-wei” medicinal herbs were determined through investigation and identification of the pathogenic fungi in Panan region of Zhejiang province， should be provided the guide for protect medical herbs planting in large scale and eco-friend condition. Pathogenic fungi strains were separated from the infected leaves of medicinal herbs by plate separation in fertile medium. These pathogens were identified by construction of fungal ITS phylogenetic tree， and then analysis of colonial morphology and microstructure. 9 types of pathogenic fungi were finally obtained， namely Alternaria sp.， Fusarium oxysporum， Chaetomium globosum， Hypocrea virens， Cochliobolus lunatus， Nigrospora sphaerica， Fusarium equiseti， Colletotrichum dematium， Phoma sp. Compared with the related reports and Koch's postulates， the local medical herbs became new hosts for the three pathogenes. In these pathogens， Cochliobolus lunatus was the causative agent of brown spot diseases in White Paeony Root ‘An hui bozhou， Colletotrichum dematium induced anthracnose in Liriope platyphylla ‘Panan and Chaetomium globosum caused the leaf blight of Chrysanthemum‘Zao xiao yang ju.

Key words：“Zhe-ba-wei”； medicinal herbs； pathogenic fungi； ITS； identification

“浙八味”作为中国主要的出口中药材，是浙江最具盛名的道地药材，分别是杭白菊（Chrysanthemum morifolium Ramat.）、玄参（Figwort Root）、麦冬（Liriope platyphylla）、白芍（Paeonia lactiflora）、白术（Atractylodes macrocephala）、温郁金（Curcuma wenyujin）、浙贝母（Fritillaria thunbergii Miq.）和延胡索（Corydalis yanhusuo）8种中药材，近年来“浙八味”药材的品质和道地日益受到高度重视和关注[1]。

随着“浙八味”种植数量的增加和规模的扩大，各种严重的病害也相继出现，如麦冬叶枯病、温郁金枯萎病、玄参叶斑病、白绢病等[2-4]，正严重威胁“浙八味”药材生产的安全和稳定。传统的病原菌分类方法主要根据菌株的形态特征、生理生化指标及生长特性来进行，包括形态学分类、生态学特征分类、生理学和真菌的菌体组成分类分析等，由于大部分病原菌形态特征复杂，并且少数形态特征随着环境的变化而变化，因此，传统的菌物分类鉴定常引起不同意见[5]。浙江磐安是中国药材之乡，是“浙八味”主要种植地区，种植规模大，病害也特别严重，一般种植人员对“浙八味”药材病原菌多采用传统分类鉴定方法，但因形态、地域的差异，结论并不一致，有时出现治疗效果欠佳，有时可能症状相似，在没确定病原菌的情况下乱试杀菌剂，增加了病原菌的抗药性和药材农药残留，对中药品质，经济效益和国际竞争力都会带来负面影响[6]。因此，平常的形态鉴定有一定局限性。ITS-PCR技术广泛应用于真菌物种的分子鉴定以及属内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析[7，8]，本研究采用此技术并结合形态特征和光学显微结构观察方法对磐安地区“浙八味”药材病原菌进行鉴定，以期为“浙八味”药材病害进行有效防治提供科学依据，这具有重要的生态学意义和经济价值[9]。

1 材料与方法

1.1 供试材料

2013年6月，对浙江磐安中药材种植基地“浙八味”药材病害情况进行了调查，并收集感病叶片。所用供试材料为：红花芍药（Paeonia lactiflora）、早小洋菊（Chrysanthemum）、细叶白术、玄参（Figwort Root）、金菊（Chrysanthemum）2号、安徽亳州白芍（Paeonia lactiflora）、温郁金、磐安阔叶麦冬（Liriope platyphylla）。

1.2 病原菌的分离与纯化

取有病原菌部分的叶片，用无菌水冲洗4次，在无菌条件下晾干并用灭过菌的剪刀将有病原菌部分的叶片剪成1 cm×1 cm小块，放在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上，25 ℃恒温黑暗倒置培养，经过48 h发现不同症状的叶片上有明显的菌丝产生，再把各种不同症状的菌丝从培养基边缘挑取，并转移至新PDA平板上，重复至获得纯培养物后，将PDA斜面置于4 ℃保存。

1.3 病原菌菌落形态与显微观察

把前期纯化保存的菌种置于新鲜PDA平板培养，至病原菌生长到离平板边缘约5 mm时，进行外观形态拍照记存；并在无菌条件下挑取部分菌丝置于干净的载玻片上，用乳酸酚棉蓝染色液浸染5 min，盖上盖玻片保存，在400×显微镜（Nikon 90i）下观察拍照记存。

1.4 病原菌分子鉴定

1.4.1 DNA提取与rDNA间隔区序列的PCR扩增 DNA提取参考曹梦洁等[10]试验方法进行，利用通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）与ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），扩增病原菌rDNA ITS片段[11]，PCR反应体系见表1。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸反应45 s，35个循环，72 ℃延伸反应10 min，4 ℃保存。

1.4.2 ITS序列测定与数据分析 把经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后的PCR产物送上海桑尼生物公司进行双向测序，获得序列与Genbank中的核酸数据进行同源性比对[12]，试验所获得的病原菌与序列同源性最高的真菌为同一属，利用MEGA 5.10软件进行多序列匹配排列，对试验获得病原菌序列与数据库中登录的近源菌株间的真菌一起构建系统发育树进行分析。

2 结果与分析

2.1 病原菌菌株分离结果与序列分析

“浙八味”药材致病叶片通过PDA平板分离技术总共收集到20株病原菌样品，通过ITS序列测定与NCBI GenBank数据库进行BLAST比对，对获得高同源性的序列一起通过MEGA 5.10软件构建系统发育树，见图1。

从图1中可以看出，样品中的F13Q-2、F13D-2与登入号（GU130297.1）中的菌同源性高达100%，根据rDNA ITS 区序列分析准则[13]可初步确定该菌为肉座菌属（Hypocrea）真菌。具有高度同源性的F13K-2、F13K-1b与登入号（JQ677042.1）中的菌聚为一支，为刺盘孢属（Colletotrichum）真菌；F13I-2、F13Q-1与登入号（HM210092.1）中的菌聚为一支，F13E-1、F13F-2、F13P-2与登入号（AB425996.1）中的菌聚为一支，两者同属于镰刀菌属（Fusarium）；F13V-1b、F13V-1a与登入号（HQ631 000.1）中的菌聚为一小支，支持率为67%，再和F13V-3a与登入号（JQ388280.1）中的菌聚为一支，为茎点霉属（Phoma）真菌；F13R-1、F13K-3、F13L-1、F13I-1、F13H-1与登入号（KC920885.1）中菌聚为一支，为链格孢属（Alternaria）真菌；F13N-1b、F13U-1、F13A-2分别与登入号（JN689341.1、KC519729.1、DQ836800.1）中菌各聚一支，分别为毛壳属（Chaetomium）真菌、黑孢霉属（Nigrospora）真菌和旋孢腔菌属（Cochliobolus）真菌。

试验获得20株病原菌分属于8个真菌属。20株病原菌的来源、GenBank登入号、测序大小、病害特征等结果见表2。

2.2 病原菌菌落形态与显微结构

从PDA平板观察20株病原菌，形态相似的归为一类，总共可分为9类。并挑每类中外观特征较好的一种菌进行拍照和显微观察（全自动正置荧光DIC显微镜及成像系统），PDA平板菌落图和显微结构特征见图2和图3。20株病原菌的原始菌落形态和显微结构特征描述见表3。

2.3 病原菌综合鉴定

植物病原菌种类繁多，形态复杂，对这些病原菌仅从形态学来进行鉴定，有一定的局限性[14]。基于ITS 序列的分子标记技术鉴定具有简便、快速等特点，对属内种间的分类鉴定具有一定的客观合理性[15]。本研究通过ITS序列与形态、显微结构综合观察，并查阅文献，综合确定从磐安地区部分“浙八味”药材中共分离获得9种病原菌，分别为链格孢菌（Alternaria sp.）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、球毛壳菌（Chaetomium globosum）、绿色木霉菌（Hypocrea virens）、月状旋孢腔菌（Cochliobolus lunatus）、球孢黑孢霉（Nigrospora sphaerica）、木贼镰刀菌（Fusarium equiseti）、束状刺盘孢（Colletotrichum dematium）和茎点霉菌（Phoma sp.）。

3 小结与讨论

“浙八味”作为著名的药用植物，有很多功能，芍药的提取物因含单萜苷、芍药苷和一些酚类化合物，可以治疗关节炎、肝炎[16-18]。随着种植规模的扩大，近年来，药用植物的真菌病害屡见报道，桑维钧等[19]研究发现斑点叶点霉（Phyllosticta commonsii）、尖孢镰刀菌可引起白术的叶斑病和枯萎病。陈小红等[20]报道的玄参叶点霉（Phyllosticta scrophulariae）、炭疽菌（Colletot richum sp.）能引起玄参斑点病和芍药炭疽病。罗有强等[2]曾报道胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）可引起山麦冬叶枯病。但随着区域不同、季节变换，以及杀菌剂的使用，真菌病害也会有一定变化。目前，控制真菌病原体的主要方法是使用杀菌剂，但连续多年应用相同杀菌剂，使得一些真菌已经产生抗药性[21]，因此对某一药材主产区病害情况进行系统排查，确定突出的病原菌情况对当地的药材生产有很大的现实指导意义。然而由于传统的病原菌形态学鉴定方法受主观经验与试验条件等影响而使鉴定工作有一定的局限性，单凭一种性状是不可取的，只有互相验证，互为证据，才能更全面地对病原菌形态学进行鉴定。因此，在对病原菌鉴定分类时，综合生理学性状、生化性状、形态学性状和分子学性状等信息是一种补充手段[22，23]。随着生物技术的发展，以ITS序列分析为代表的分子生物学方法为病原菌鉴定带来了希望，但rDNA-ITS序列分析也受到比对使用的基因库完善程度的影响，在基因库缺乏与待检病原菌亲缘关系相近的已知病原菌序列时或rDNA- ITS序列上表现为极小的差异性时，ITS序列分析就会受到一定的限制[23]。因此建议将ITS序列分析结果与传统的病原菌形态学鉴定结果（包括显微结构和菌落形态等）相结合才能更准确地对病原菌进行鉴定，以防止偏面性。