产脂肪酶黑曲霉摇瓶发酵条件优化研究

张谦贾佳林智杨晓锋郭宏涛王剑英Carol Sze Ki Lin

（1.深圳技师学院，深圳 518116；2.深圳市绿微康生物工程有限公司，深圳 518055；3.香港城市大学能源与环境学院，香港）

产脂肪酶黑曲霉摇瓶发酵条件优化研究

张谦1贾佳2林智2杨晓锋3郭宏涛2王剑英2Carol Sze Ki Lin3

（1.深圳技师学院，深圳 518116；2.深圳市绿微康生物工程有限公司，深圳 518055；3.香港城市大学能源与环境学院，香港）

黑曲霉Aspergillus niger G62s是一株具有遗传稳定的高产脂肪酶菌株。针对于G62s摇瓶发酵条件进行统计学优化研究，以提高该菌株的产脂肪酶能力。首先，采用单因素方法对发酵接种量、摇瓶装量、培养温度、培养时间等因素进行考查，在此基础上进行4因素3水平的响应面分析（Response surface methodology，RSM）的统计学优化。得到的优化发酵条件是接种量1.9 %，摇瓶装量56 mL（500 mL摇瓶），培养温度30oC，培养时间75 h。在该优化条件下，脂肪酶活性达到（212 9 ± 39.9）U/mL，相比初始的发酵条件提高16.7%。针对于影响G62s菌株产脂肪酶的4个发酵条件，在单因素实验的基础上通过RSM方法优化，显著提高了目标菌株脂肪酶产量。

黑曲霉；脂肪酶；单因素方法；响应面分析方法；发酵条件优化

脂肪酶（lipase，EC.3.1.1.3）又称为三酰基甘油酰基水解酶（triacylglycerol acylhydrolase）是一类特殊的酯键水解酶，可以催化三酰甘油酯及其它一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应［1-4］。脂肪酶是动物体内脂肪代谢的关键酶，被广泛应用于饲料添加、洗涤业、油脂改良、食品加工等诸多领域，是一种有较大开发价值和应用前景的多功能生物催化剂［5，6］。目前，脂肪酶的工业制备主要采用微生物发酵的方法。黑曲霉（Aspergillus niger）是一种工业上重要的微生物，被广泛用于生产脂肪酶、纤维素酶、木聚糖酶等30多种酶制剂，且被美国FDA认定为GRAS（通常认为是安全的）菌株，其发酵产生的脂肪酶产品可以作为药品、食品和饲料的辅料及添加剂等［7，8］。应用黑曲霉进行脂肪酶生产的另一优势是，黑曲霉能够将脂肪酶分泌到发酵液中，从而降低下游纯化成本［9］。目前，运用工业育种技术、培养基和发酵条件优化改良等方法进行提高菌种产量，降低发酵成本，是实现节能减排、提高企业竞争力的重要手段之一［10］。

响应面分析方法（Response surface methodology，RSM）是采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对函数响应面和等高线的分析，能够精确地研究各因子与响应值之间的关系，寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法。而Box-Behnken Design（BBD）是RSM常用的实验设计方法之一，是以较少的试验次数获得最有效、最经济试验设计和因素优化的方法，并且适用于摇瓶实验［11，12］。近年来，RSM方法广泛应用于各种微生物发酵不同品种的培养基、培养条件及发酵工艺的优化设计中［5，12-14］。

本文针对于产脂肪酶黑曲霉A. niger G62s菌株的摇瓶发酵条件进行优化研究，采用单因素方法考察影响菌株发酵及产酶特性的接种量、摇瓶装量、培养温度、培养时间等条件，在此基础上采用RSM对于4个主要影响产酶因素进行优化，以提高菌株产脂肪酶的能力。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 黑曲霉A. niger为深圳绿微康生物工程有限公司提供的生产菌株，该菌株现保藏于公司酶制剂研究中心，保藏号：A. niger G62s。

1.1.2 试剂和仪器 主要试剂 酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、玉米淀粉、豆粕、无机盐、琼脂等培养基所用试剂均为国产化学级试剂，蛋白Marker为美国thermo公司产品，脂肪酶分析所用试剂为分析级试剂。仪器 净化工作台，苏州净化设备厂；PHS-25型酸度计，杭州科晓化工仪器设备有限公司；Avanti J-30I型高效离心机，美国贝克曼库尔特有限公司；TS-3112型双层大容量摇床，上海仪纯实业有限公司；JY600凝胶电泳仪，北京君意东方电泳设备有限公司。

1.1.3 培养基 斜面培养基（YPD）酵母膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，琼脂 15 g，蒸馏水定容至1 000 mL，pH7.0。种子培养基 葡萄糖 30 g，NaNO37 g，NaH2PO40.5 g，K2SO40.1 g，蒸馏水定容至1 000 mL，pH 7.2。发酵培养基 葡萄糖 20 g，玉米淀粉 10 g，豆粕 30 g，橄榄油 5 g，NaNO310 g，NaH2PO42 g，K2SO40.2 g，CaCO35 g，蒸馏水定容至1 000 mL，pH7.2。

1.2 方法

1.2.1 菌株培养方法 斜面种子培养方法：将-80℃保藏的菌株冷冻管，用接种针取1环均匀涂布于斜面培养基表面，于30℃恒温静置培养7 d，制备成斜面种子，于3-5℃冰箱保存备用。摇瓶种子培养方法：将斜面种子用接种针取1环接种于装有30 mL种子培养基的250 mL摇瓶中，于30℃恒温220 r/min振荡培养20-32 h，见培养液浑浊，OD600值为0.24-0.5，得到摇瓶种子液备用。摇瓶发酵方法：选用500 mL摇瓶，发酵培养基装量为50 mL。摇瓶接种量按照装量的1.5%进行转种。培养温度为30℃恒温培养，220 r/min振荡培养，发酵培养时间66 h。培养好的发酵液在10 000 r/min，4℃低温下离心10 min，取上清液检测脂肪酶活性。

侵入岩比较发育，主要为位于矿区南部约8km处面积约60km2花岗岩，为华力西中期第二次侵入花岗岩，呈不规则状岩基侵入于大哈拉军山组内，亦见有闪长岩、花岗闪长岩、辉长岩、辉绿岩呈小岩株、岩脉存在。阿尔恰勒铅锌矿床附近主要见有辉绿岩脉。

1.2.2 单因素实验方法 在摇瓶中分别对于发酵过程的接种量、摇瓶装量、培养时间、培养温度等进行单因素实验，筛选出对酶活性影响较为显著的因素和合理的取值范围。

1.2.3 RSM方法 采用“Design-Expert 8.0”软件，以脂肪酶活性为响应值，对单因素实验得到的较为显著的影响因素进行RSM设计（表1）。采用BBD模型，得到4因素3水平共29组的试验设计，实验为3批，每批平行3瓶。实验得到的数据在“ Design-Expert 8.0”软件中的BBD模型对数据进行拟合和分析，通过ANOVA分析得到二次多项式，最终确定最优化发酵条件。

1.2.4 SDS-PAGE电泳分析 取发酵液上清20 μL，加入5 μL Loading Buffer（5×），进行SDS-PAGE电泳分析，电泳完毕后用考马斯亮蓝R250染色过夜，然后脱色获得清晰的电泳条带为止。

1.2.5 脂肪酶活性测定方法 以碱滴定法测定发酵液中脂肪酶活性。取1 mL发酵液上清液，加入5 mL橄榄油和4 mL的glycine-NaCl缓冲液（pH9.4，50 mmol/L）振荡混匀，在36℃孵育15 min，加入20 mL的95%乙醇和10 mL的30% NaCl溶液终止反应。脂肪酶活性单位定义为，在一定温度和pH条件下，1 min水解底物产生1 μmol的可滴定的脂肪酸，即为1个酶活单位，以U/mL表示［15，16］。

表1 BBD方法试验的变量范围

2 结果

2.1 摇瓶发酵条件的单因素优化

首先采用单因素实验，对接种量、摇瓶装量、发酵培养温度和培养温度等4个主要的发酵条件进行初步的研究。根据A.niger G62s菌种的发酵特性，确定各个待考察因素水平，对于各个因素的取值范围比较宽，以保证试验结果能够覆盖高值点。取值范围为接种量为0.5%-4.0%，摇瓶装量为30-100 mL，发酵培养温度为25-45℃，发酵培养时间为48-96 h（图1-图4）。

图1 摇瓶接种量对于脂肪酶活性的影响（n=9）

图2 摇瓶装量对于脂肪酶活性的影响（n=9）

图3 培养温度对于脂肪酶活性的影响（n=9）

图4 培养时间对于脂肪酶活性的影响（n=9）

G62s菌株在接种量为0.5%时发酵不稳定，增加接种量有利于菌株产脂肪酶。当接种量增加至2%时，发酵液的脂肪酶活性最高。而接种量继续增加，在大于2.5%时菌株产酶能力随之降低（图1）。摇瓶装量的改变主要是影响通气量，当摇瓶装量≥50 mL时，菌株产酶能力趋于稳定，随着摇瓶装量的增加，菌种的产酶能力没有显著降低（图2），说明该菌株发酵过程对于摇瓶装量和通气量的要求不高。培养温度可以影响菌种产脂肪酶的稳定性和能力。本实验的结果（图3）显示，适于G62s产脂肪酶的发酵培养温度在30-32℃之间，温度过低或过高都不利于脂肪酶的产生。最适发酵培养时间则为66-78 h，延长发酵培养时间到84 h脂肪酶活性显著降低（图4）。通过单因素考察，确定发酵条件为：接种量为2.0%，摇瓶装量为50 mL（500 mL摇瓶），培养温度为30℃，培养时间为72 h。

在单因素实验基础上，采用Design-Expert 8.0软件RSM的BBD设计，针对于影响发酵的接种量（A），摇瓶装量（B），培养温度（C），培养时间（D）进行优化分析，以脂肪酶活性为响应值（Y），选择4因素，3水平，共29组实验，其中有6组为中心点重复实验（表2）。

表2 BBD实验设计及结果

将得到的数据，输入至Design-Expert 8.0软件中，进行多元回归拟合，得到Y值对编码自变量A、B、C、D的二元多次回归方程为：

Y = 2 085.8 + 70.67 A + 33.75 B + 63.92 C + 83.33 D - 43.25 AB + 10.5 AC - 77.25 AD - 54.75 BC - 19.75 BD - 54.5 CD - 100.15 A2- 26.53 B2- 75.02 C2- 77.9 D2

在该拟合方程的基础上，对试验数据进行统计分析和模型方差分析（表3）。结果显示，模型决定系数R2=0.934 5， 信噪比Adeq Precision = 13.22，表明方程的拟合度与可信度较高，实验误差较小。所选用的模型的P值检验显著（P＜0.000 1），说明方程拟合度较好。失拟项P = 0.098 3（P＞0.05），说明失拟项差异不显著，模型产生的残差值是由随机误差引起。由此可以认为该模型的选择合理，并且能够对响应值Y进行分析和预测。

根据表3对于模型所列4个变量的方差分析，在检验项P＜0.05的说明该项的影响是显著的，否则为不显著。该模型的一次项A，B，C，D、二次项A2，C2，D2以及交互项中AD，BC，CD对于Y值影响显著（P ＜ 0.05）。其中，交互项AD影响最大（P=0.003＜0.05），即接种量与培养时间之间的交互作用最大。而其他的3个交互项AB、AC、BD，则对于Y值影响不显著（P ＞ 0.05）。

表3 脂肪酶活性的回归方程及模型方差分析a

根据方差分析得出AD、BC、CD交互项对于Y值的影响（图5）。进一步对于回归方程进行求导，得到极值点，即Y最大化时各个因素水平的取值。由软件预测可得，接种量（A）为1.9%，摇瓶装量（B）为56 mL（500 mL摇瓶），培养温度（C）为30℃，培养时间（D）为75 h。并预测在此优化的条件下，G62s菌株的产脂肪酶活性为2 121 U/mL。

图5 因素交互作用对于脂肪酶活性的响应面分析

2.3 SDS-PAGE分析结果

按照RSM优化前后的发酵条件对于G62s菌株的发酵液进行SDS-PAGE分析，结果（图6）显示在箭头所指位置出现了明显的蛋白条带，说明发酵条件优化前后所产脂肪酶的相对分子量没有改变。根据软件Gel-pro 3.0计算，该条带的分子量约为33.2 kD。

图6 G62s的SDS-PAGE分析

2.4 验证实验

按照RSM优化后的摇瓶发酵条件对于G62s菌株进行验证实验，并检测脂肪酶活性，以验证RSM得到的预测值。试验进行3批，每批平行3瓶。结果（表4）可见，优化的发酵条件其脂肪酶活性为2 129 ± 39.9 U/mL，与预测值相符（相差0.4%）。与初始发酵条件下发酵比较，脂肪酶活性提高16.7%（C.V. = 1.87%，P ＜ 0.01，差异显著），说明经过RSM优化后菌株的产脂肪酶活性获得了稳定提高。

表4 发酵条件的验证试验（n = 9）

3 讨论

近年来，微生物发酵产生代谢物的研究越来越多，由于培养基的内在条件（培养基组成、浓度等）及外在条件（发酵温度、时间、通气量等）都会影响微生物的生长与代谢产物的积累，因此对于发酵培养条件的优化成为了研究的热点［17］。在微生物的发酵实验中单因素方法可以最直接、有效地反应各个因素对于菌株影响，广泛应用于发酵条件的优化和菌株的特性考察［18-20］。响应面法是一种有效的统计方法，可以在更广泛的范围内考虑因素的组合、预测响应值，比一次次的单因素分析方法和正交试验更有效，因此，响应面法会更加广泛应用于发酵培养基工艺条件优化的研究中。响应面分析的关键因素包括：选择合适的研究对象及合适的实验水平，建立一个可信的有效的模型。评估相关性，预测响应值考察模型的准确性等［17，21］。王挥等［22］采用单因素试验和RSM对黑曲霉产单宁酶的摇瓶发酵条件进行优化，确定单宁浓度、培养温度、培养时间为发酵产酶影响最大的因素。其最适产酶条件为：培养温度31.7℃，转速180 r/min，单宁浓度1.5%，初始pH6.0，接种量10%，装液量20%，培养时间72 h，得到的酶活力最高值1 141.82 U/mL。吴茜茜等［23］采用单因素试验和RSM优化设计了黑曲霉（A. niger PZ321）发酵异淀粉酶的摇瓶培养条件，筛选出硝酸铵、接种量、培养温度3个主要因素，确定了最优化培养条件为接种量2%，30℃培养72 h，酶活为137.3 μ/mL；比基础培养基提高了1.71倍。本研究通过单因素方法结合BBD优化，得到了影响G62s菌株脂肪酶产量的主要影响因素，分析各因素之间的相互关系，得到了最优化的摇瓶发酵条件。其中，摇瓶接种由最初的1.5%提高到1.9%；摇瓶装量由50 mL提高到56 mL；培养温度30℃不变；培养时间由66 h延长到75 h，在最佳摇瓶发酵条件组合下，黑曲霉G62s的脂肪酶产量可以增至（2 129±39.9）U/mL，提高了16.7%。本研究结果与上述报道比较，尽管发酵的酶有差异，但是均为黑曲霉的发酵，其优化结果基本一致。G62s菌株发酵SDS-PAGE分析结果显示，摇瓶发酵条件改变没有影响脂肪酶的相对分子量。说明采用单因素试验和RSM优化法，对提高黑曲霉脂肪酶产量是很有效的。

4 结论

黑曲霉G62s优化后的摇瓶发酵条件：在装液量56 mL的500 mL摇瓶中，1.9%接种量，于30℃培养时间75 h可得到最优化的脂肪酶产量。

G62s菌株在优化后的发酵条件下发酵得到脂肪酶活性为（2 129±39.9）U/mL，与模型预测值相符，脂肪酶活性提高16.7%，而且发酵稳定。在单因素实验的基础上通过RSM方法优化发酵培养条件，显著提高了目标菌株的脂肪酶产量。

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（责任编辑 李楠）

The Optimization of Flask Fermentation Conditions for the Production of Extracellular Lipase from Aspergillus niger

Zhang Qian1Jia Jia2Lin Zhi2Yang Xiaofeng3Guo Hongtao2Wang Jianying2Carol Sze Ki Lin3
（1. Shenzhen Institute Technology，Shenzhen 518116；2. Shenzhen Leveking Bio-engineening Co.，LTD，Guangdong Shenzhen 518055；3. School of Energy and Environment，City University of Hong Kong，Hong Kong）

Aspergillus niger G62s is a genetically stable strain of producing high-yield lipase. This work is to have statistic optimization for the flask fermentation conditions of G62s aiming at increasing the capacity of strain yielding lipase. Firstly， using single-factor test， the effects of these 4 parameters， i.e.， the inoculation amount， working volume， culture temperature and culture time， on the lipase yield were studied. Then the key parameters of fermentation conditions were statistically optimized through the response surface methodology（RSM）with 4 factors in 3 levels. The optimal conditions were 1.9% inoculum size in 56 mL working volume（in 500 mL flasks）at 30oC for 75 h. Using these conditions，the activity of lipase reached 212 9±39.9 U/mL， increased 16.7% comparing to that of the initial fermentation conditions. In conclusion， based on the single-factor test of 4 fermentation factors affecting the lipase yield of G62s， optimization by RSM significantly increased the yield of the target strain.

Aspergillus niger；lipase；single-factor test；response surface methodology；optimization of fermentation conditions

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.033

2015-03-18

深圳市科技创新委员会技术创新计划项目（CXZZ20130425111508558）

张谦，男，高级工程师，研究方向：工业微生物及发酵工程；E-mail：qianz@yeah.net