硝酸银-硅胶柱层析法分离纯化核桃油中亚麻酸工艺研究

张卫民，翟元春，杨红军，张润光，郝　剑，韩军岐，张有林，*

（1.西安市林业技术推广中心，陕西西安710061；2.陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安710119）

硝酸银-硅胶柱层析法分离纯化核桃油中亚麻酸工艺研究

张卫民1，翟元春2，杨红军1，张润光2，郝剑1，韩军岐2，张有林2，*

（1.西安市林业技术推广中心，陕西西安710061；2.陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安710119）

先采用尿素包合法对核桃油中脂肪酸进行初步分离，在此基础上利用硝酸银-硅胶柱层析法对核桃油中亚麻酸进一步纯化，20g硅胶中与2g AgNO3配制成硝酸银硅胶柱中，加入与吸附剂比例为1∶15的经尿素包合后富集得到的脂肪酸，洗脱剂流速为0.6mL/min，丙酮-石油醚浓度为8%时，核桃油中亚麻酸由原来的8.7%洗脱后提高到95.9%，以上结果表明硝酸银-硅胶柱层析法是一种高效分离亚麻酸的方法。

核桃油，硝酸银-硅胶，亚麻酸

核桃仁富含脂肪、蛋白质、维生素和矿物元素，脂肪含量达60%～70%［1］，核桃油中不饱和脂肪酸含量明显高于一般食用油［2］。核桃油中含有的亚油酸和亚麻酸是人体必需脂肪酸，其中亚麻酸被称作“21世纪绿色营养保健食品”［3］，具有清除血液中甘油三酯，降低内源性TC合成的作用。在去饱和酶和碳链延长酶作用下，亚麻酸可以转变为二十二碳六烯酸（20∶6，Docosahexaenoic Acid，DHA）和二十碳五烯酸（20∶5，Eicosapentenoic acid，EPA），这两种脂肪酸均具有降血脂，增强大脑机能，预防动脉粥样硬化的功效［4-6］。

目前分离不饱和脂肪酸的方法主要有：尿素包合法、超临界流体萃取法、分子蒸馏法、银离子配位法、吸附分离法等，其中吸附分离法中的硝酸银-硅胶柱法具有易操作、设备简单等优点。与尿素包合法相比，硝酸银-硅胶柱法具有进一步分离纯化脂肪酸的作用，尤其对碳链数目相近的不饱和脂肪酸分离效果甚为明显。硝酸银-硅胶柱层析法属络合层析，其基本原理是利用吸附在硅胶上的银离子与不饱和脂肪酸中的-C=C-发生电子迁移形成π络合物，通过改变各饱和度不同的脂肪酸在吸附剂上的分配系数，从而实现分离［7-9］。近几年，国内外已多次使用硝酸银-硅胶柱法分离动植物油中多不饱和脂肪酸及其甲酯，但未见其在核桃油中的应用。本实验以硝酸银-硅胶H为吸附剂，研究了硝酸银-硅胶柱层析法中几个重要因素对核桃油中亚麻酸分离纯化的影响，为从核桃油中分离亚麻酸提供技术参数。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

供试核桃品种为香菱，由西安市核桃种质资源圃提供；核桃油由香菱核桃品种取仁采用冷榨法制得；尿素、无水硫酸钠、95%乙醇、石油醚（30～60℃）、石油醚（60～90℃）、丙酮、甲醇、硫酸、氢氧化钾、盐酸等均为分析纯，由天津市天力化学试剂有限公司提供；异辛烷为色谱纯；棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸混合甲酯标准品由美国Sigma公司提供，纯度＞99.6%。

气相色谱仪（TRACE2000，ThermoFisher Scientific，USA）配备火焰离子化检测器（Flame Ionization Detector，FID），美国菲尼根公司；SHZ-D（III）循环水式真空泵巩义市予华仪器有限责任公司；RE-52旋转式蒸发器上海安亭实验仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1脂肪酸混合液制备参照文献［10］中的方法，称取50g核桃油于烧瓶中，加入200mL 4%的氢氧化钾-95%乙醇溶液，用磁力搅拌器缓慢搅拌升温至75℃，皂化回流2h至皂化完全。加入一定量温水，继续搅拌30min使其皂化物充分溶解，在上述反应液中缓慢加入20%的盐酸调节pH约为2，恒温搅拌15min，分液漏斗分离出油层，加入200mL石油醚溶解，并用40℃温水洗涤有机层至中性，加入10g无水硫酸钠脱水，过滤，40℃旋转蒸发除去有机溶剂，得脂肪酸混合液，称取重量。

1.2.2尿素包合法纯化核桃油中亚麻酸参考文献［11］中的方法。

1.2.3硝酸银化硅胶柱层析法纯化核桃油中亚麻酸硝酸银化硅胶制备：参考文献［12］中方法，稍作修改。

以丙酮-石油醚作为洗脱剂，设计尿素包合后脂肪酸上样量与硝酸银-硅胶吸附剂用量之间比例为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，依次用0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%丙酮-石油醚混合溶液100mL进行洗脱（注：1%指100mL洗脱液中含有1mL丙酮和99mL石油醚），控制流速，每25mL收集一次洗脱液，洗脱流速设计为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL/min。

1.2.4气相色谱分析脂肪酸甲酯化［13］：取脂肪酸样品0.1g于烧瓶中，向其中加入2mL 1%硫酸-甲醇溶液，于70℃水浴锅中甲酯化30min。给经甲酯化的脂肪酸样品中加入2mL色谱纯异辛烷，倒入适量蒸馏水至瓶颈处，静止分层，取异辛烷层进行气相色谱分析。

气相色谱条件：使用HP-INNOWAX石英毛细管色谱柱（30m×0.32mm×0.25μm）；采用程序升温模式，起始温度140℃，保持5min，后以4℃/min升至220℃，保持15min；进样口温度260℃，检测器温度280℃；以氮气为载气，流速1.0mL/min；分流进样，分流比20∶1，进样量1μL，检测器为FID，利用面积归一法求出各组样品中亚麻酸的纯度。

2　结果与分析

2.1尿素包合前后核桃油中脂肪酸组成

通过前期大量实验最终确定包合工艺条件为：包合时间为24h，包合温度为-10℃，m1（混合脂肪酸）∶m2（尿素）为0.3，V（95%乙醇）∶m2（尿素）为4，经过一次尿素包合分离纯化使得核桃油中亚麻酸含量由原来的8.7%提高为19.5%。冷榨后的核桃油，尿素包合前与包合后分别测定了脂肪酸的组成，结果见表1。

表1　尿素包合前后核桃油中脂肪酸组成Table 1　The fatty acid composition of walnut oil before and after the urea inclusion

由表1可知，冷榨核桃油主要由五种脂肪酸组成，其中棕榈酸8.1%，硬脂酸2.9%，油酸28.1%，亚油酸52.1%，亚麻酸8.7%，尿素包合后亚油酸、亚麻酸得到了富集，相对含量分别提高到了80.2%和19.5%。饱和脂肪酸及单不饱和脂肪酸含量降至最低。用尿素包合法初步分离核桃油中饱和程度不同的脂肪酸效果良好。

2.2硝酸银硅胶柱层析法分离纯化核桃油中亚麻酸条件优化

2.2.1最佳上样量确定以核桃油中亚麻酸相对含量作为指标，固定洗脱浓度为6%，流速为0.4mL/min，确定最佳上样量，结果见图1。由图1看出，随着上样量与吸附剂比例的增加，亚麻酸含量呈现先增后减的趋势。上样量逐渐增多，样品与吸附剂间作用逐渐增强。当上样量与吸附剂的比例达到适当过载的最佳状态1∶15时，核桃油中亚麻酸含量明显高于其他比例（p＜0.05），达到82.5%，之后柱效均有所下降（p＞0.05）。这些差异主要是由于层析柱分离效果所决定。当上样量不足时，样品中脂肪酸浓度较低，扩散作用对传质的影响相对较大，柱效分离低。当样品过载程度过大，影响柱子的分离效果，降低体系中亚麻酸的含量。考虑到实验要求和硝酸银成本问题，最终选定上样量与吸附剂比例1∶15为佳。

图1　上样量与吸附剂比例对亚麻酸含量的影响Fig.1　Sample amount and proportion of adsorbent on the influence of linolenic acid content

2.2.2不同浓度洗脱剂对亚麻酸纯度的影响选取上样量为1∶15，流速为0.4mL/min，不同浓度洗脱液体积洗脱得到的脂肪酸含量见表2。由表2看出，用0%～2%洗脱液，样品中亚油酸和亚麻酸基本未被洗脱。用3%洗脱液75mL时亚油酸开始被大量洗出，亚麻酸洗脱极少。洗脱液浓度为5%时亚油酸洗脱基本完成，亚麻酸开始被大量洗脱，继续加大洗脱液浓度，被洗脱下的亚麻酸含量逐渐增加，当用浓度为8%洗脱液75mL时亚麻酸洗脱完毕。

图2为不同浓度洗脱液洗脱时，样品中亚麻酸和亚油酸相对含量洗脱曲线图。

表2　不同浓度和用量丙酮-石油醚洗脱结果Table 2　Different concentration and dosage of acetone and petroleum ether elution result

图2　不同浓度丙酮-石油醚液对核桃油中亚油酸、亚麻酸洗脱曲线Fig.2　The elution curves of linoleic acid and linolenic acid in walnut oil under the influence of the different concentration of acetone-petroleum

由图2看出，当洗脱液浓度为3%时，亚油酸开始被大幅度洗脱下来，曲线开始明显呈上升趋势，而此时亚麻酸基本未被洗脱。洗脱液浓度为4%时，亚油酸大部分被洗脱下，亚麻酸开始洗脱，洗脱液中亚麻酸的相对含量随着洗脱液浓度增加而不断提高。亚油酸在洗脱液浓度为5%时基本被洗脱完全，洗脱液浓度为8%时亚麻酸全部被洗脱下来，洗脱液中亚麻酸含量高达95.8%。脂肪酸的极性随着双键个数的增多而增大，亚油酸为十八碳二烯酸，低浓度洗脱剂即可将其洗脱下来，亚麻酸为十八碳三烯酸，高浓度的洗脱剂可有效地将其洗脱下来，两种浓度洗脱剂存在明显分割点，使用梯度浓度洗脱可将不同脂肪酸很好地分离开来。

2.2.3最佳流速的确定选取上样量为1∶15，洗脱浓度为8%，以洗脱液中亚麻酸的相对含量作为指标，研究不同流速对实验的影响，结果见图3。

图3　洗脱剂流速对亚麻酸含量的影响Fig.3　The influence of eluent velocity of linolenic acid content

由图3可以看出，在不同的洗脱剂流速下，洗脱液中亚麻酸含量不同，随着洗脱流速的增加，亚麻酸的相对含量整体呈现先增加后降低的趋势。当洗脱流速达到0.6mL/min时亚麻酸相对含量显著高于其他洗脱流速下的亚麻酸相对含量（p＜0.05），当洗脱流速为0.4、0.8、1.0mL/min时差异不显著（p＞0.05）。依据吸附理论，样品中的组分与固定相表面的活性位会产生亲和作用而吸附到固定相上。较低流速时，样品在轴向的扩散速度变大，使得样品纵向的速度小于轴向洗脱速度，使得部分洗脱物扩散，洗脱液中亚麻酸含量减少。但洗脱流速过快，则固定相与流动相之间难以建立分离平衡，影响洗脱效果，通过实验分析得出，当洗脱剂流速0.6mL/min时，亚麻酸含量为86.4%，效果最佳。

2.3洗脱液气相色谱分析结果

将硝酸银硅胶柱对亚麻酸的分离纯化效果用气相色谱法进行测定，结果见图4、图5和表3。由图4、图5可以看出，经硝酸银硅胶柱分离纯化，亚麻酸纯度得到了极大提高。由表3看出，油脂中亚麻酸的相对含量由冷榨油中的8.7%提高到了95.9%。

图4　脂肪酸标准品气相色谱图Fig.4　Fatty acids standard by gas chromatogram

图5　柱层析后样品脂肪酸气相色谱图Fig.5　After column chromatography of samples of fatty acids by gas chromatogram

表3　脂肪酸标准品和层析后样品脂肪酸组成Table 3　The composition of standard fatty acid and after column chromatography of samples fatty acid

3　结论

先用尿素包合法使亚麻酸的相对含量由冷榨油的8.7%上升到了19.5%。在20g硅胶中与2g AgNO3配制成硝酸银硅胶柱中，加入与吸附剂比例为1∶15的经尿素包合后富集得到的脂肪酸，控制洗脱剂流速为0.6mL/min，在洗脱液浓度为8%时，洗脱完毕洗脱液中亚麻酸的含量达到95.8%，与冷榨核桃油相比，纯度提高了87.1%，通过尿素包合法与硝酸银化硅胶联合应用使核桃油中亚麻酸的纯度得到大幅度提高，该方法简单易行，可大规模分离纯化亚麻酸。

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Silver nitrate-silica gel column chromatography purification linolenic acid in the walnut oil

ZHANG Wei-min1，ZHAI Yuan-chun2，YANG Hong-jun1，ZHANG Run-guang2，HAO Jian1，HAN Jun-qi2，ZHANG You-lin2，*
（1.Forestry Technology Promotion Center of Xi’an，Xi’an 710061，China；2.Shaanxi Normal University Food Engineering and School of Nutrition Science，Xi’an 710119，China）

The fatty acids of walnut oil were separated primarily by urea adduction method，then the linolenic acid of walnut oil was further purified by silver nitrate-silica gel column chromatography.In the silver silica gel column formed by 20g silica gel and 2g AgNO3，join in the ratio was 1∶15 with adsorbent after urea inclusion enrichment of fatty acids，100mL 8%acetone-petroleum，underd the elution flow rate of 0.6mL/min，the content of linoleic acid in walnut oil increased from the original 8.7%to 95.9%.This suggests that the silver nitrate-silica gel column chromatography is a kind of high efficient separation method of linolenic acid.

walnut oil；silver nitrate-silica gel；linoleic acid

TS201.1

B

1002-0306（2015）10-0229-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.039

2014－08－14

张卫民（1969-），男，硕士研究生，工程师，主要从事林业技术推广与林产品加工方面的研究。

张有林（1956-），男，教授，研究方向：农产品加工及贮藏。

中央财政林业科技推广示范跨区域重点推广示范项目（2011TK109）；西安市现代农业创新计划项目（NC1317.3）。