牛奶中三种糖醇类甜味剂的气相色谱测定及前处理方法研究

曹玉林，束天锋，刘艳玲，薛秀恒，梅　林，王志耕，孙郭艳

（安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽省农产品加工工程实验室，安徽合肥230036）

牛奶中三种糖醇类甜味剂的气相色谱测定及前处理方法研究

曹玉林，束天锋，刘艳玲，薛秀恒*，梅林，王志耕，孙郭艳

（安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽省农产品加工工程实验室，安徽合肥230036）

利用冷冻干燥处理与毛细管气相色谱外标法测定牛奶中的糖醇类甜味剂。牛奶用乙酸锌和氢氧化钡除去蛋白质后，经冷冻干燥，样品中的糖醇与吡啶-乙酸酐（1∶1，v/v）于90℃反应30min，生成的糖醇乙酰酯衍生物经HP-5毛细管柱色谱分离，氢火焰离子化检测器检测。结果表明：与旋转蒸发相比，冷冻干燥处理样品的回收率更高。在优化的色谱条件下，本方法在10～90μg/mL范围内线性关系良好（r=0.9974～0.9999），重复性好（RSD=1.37%～2.04%），平均加标回收率在91.17%～92.06%之间。该方法简单、快速、灵敏，适用于牛奶中糖醇类甜味剂含量的测定。

牛奶，糖醇，冷冻干燥，气相色谱

在人类众多的食品中，乳占有特殊的地位［1］。通常牛乳中蛋白质含量约为3.5%，是人类蛋白质的主要来源之一［2］，而且牛乳中还含有微量的糖醇如赤藓糖醇、甘露糖醇等［3-4］。中国现有9240万糖尿病患者［5］，龋齿和肥胖症患者也在逐年增加［6］，而糖醇在人体代谢过程中具有多种功能特性［7］，在消化过程中，部分糖醇进入大肠，被肠内有益菌利用，只产生很低的热量［8］。糖醇不宜作为口腔微生物的营养源，长期摄入不会引起牙齿龋变［9］，同时糖醇在人体内的代谢途径与胰岛素无关，不会引起血糖和血中胰岛素水平波动，可用作糖尿病患者的特定食品［10］。因此，糖醇1类强化型牛奶正在成为乳品工业一种新的发展趋势［11］。

目前牛奶中糖醇类甜味剂检测方法较单一，主要采用配备蒸发光散射检测器［12］、二极管阵列检测器［13］、示差折光检测器［14］的高效液相色谱仪，分析速度慢，而气相色谱法高效、快速，为此，本实验研究了牛奶中糖醇含量的气相色谱测定方法，并对牛奶中蛋白质去除试剂进行优化，同时为保护色谱柱填充料和方便乙酰化处理，对比了两种干燥方法，为今后牛奶中糖醇类甜味剂的分析检测提供方法选择依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

标准阿拉伯醇、木糖醇、甘露糖醇江莱试剂有限公司，纯度99.5%；氢氧化钡、硫酸锌、三氯乙酸西陇化工股份有限公司，分析纯；丙酮、吡啶、乙酸酐国药集团化学试剂公司，分析纯；纯牛奶南京卫岗乳业有限公司。

Agilent7890B型气相色谱仪配有氢火焰离子化检测器，美国Agilent公司；HH-S型恒温水浴锅江苏国胜实验仪器厂；Allegra-64R型BECKMAN离心机美国贝克曼公司；R201型旋转蒸发仪上海申胜生物技术有限公司；MS105DU型梅特勒-托利多电子天平德国梅特勒-托利多公司；FD-1CE型冷冻干燥机北京德天佑科技有限公司；10μL微量进样器上海光正医疗仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1三种糖醇标准溶液的配制准确称取阿拉伯醇、木糖醇、甘露糖醇标准品各4mg（精确至0.01mg）于3个10mL容量瓶中，分别加入2mL吡啶，2mL乙酸酐，90℃下水浴30min，间歇振荡，使之乙酰化，取出冷却后，加丙酮定容，得到各标准品浓度为0.4mg/mL的储备液；准确吸取0.25mL三种糖醇标准储备液置10mL容量瓶中，用丙酮定容得到三种糖醇浓度分别为10μg/mL的混合标准溶液，并依照此方法配制30、50、70、90μg/mL的混合标准溶液，立即进行气相色谱分析，以峰面积（X）对相应糖醇的浓度（Y）进行线性回归分析。

1.2.2三种糖醇乙酰化条件的确定当吡啶-乙酸酐（1∶1，V/V）时，以反应温度为70、80、90、100℃，反应时间为20、30、40、50min，进行三种糖醇乙酰化［15］条件的组合实验。

1.2.3样品的前处理

1.2.3.1样品标准溶液的配制分别称取阿拉伯醇、木糖醇、甘露糖醇标准品9mg（精确至0.01mg）于100mL容量瓶中，用纯水溶解定容成三种糖醇浓度分别为90μg/mL的样品标准溶液，供加标法进行蛋白质去除试剂和干燥方法对比实验。

1.2.3.2样品的制备移取10mL纯牛奶于150mL烧杯中，加入3mL 1.2.3.1制备的样品标准溶液，得到分别加有270μg三种标准品的样品。分别加入5mL 0.3%硫酸锌溶液和0.3%氢氧化钡溶液，反应0.5h，将样液全部转移至离心管中，以10000r/min离心10min，得上清液。

1.2.3.3样品的干燥旋转蒸发瓶中的样液利用旋转蒸发仪在50℃下旋蒸至近干；将上清液全部转移至培养皿中，在-20℃预冻3h，利用冷冻干燥机在-50℃下冷冻干燥12h。

1.2.3.4样品的衍生向干燥后的样品中加入2mL吡啶，2mL乙酸酐，用保鲜膜密封培养皿，然后摇匀，90℃下水浴30min，间歇摇晃，使之乙酰化［15］。反应完毕后冷却至室温，经0.45μm有机相滤膜过滤后，立即进行气相色谱分析，以保留时间定性，外标法定量。

1.2.4色谱条件色谱柱：HP-5石英毛细管柱（30m× 320μm×0.25μm，美国Agilent公司）；进样口温度：270℃；柱温：初始温度170℃，保留2min，以10℃/min升至220℃，保留2min，再以10℃/min升至270℃，保留10min；检测器温度：280℃；载气：高纯氮，恒流模式：1.2mL/min；尾吹气：45mL/min；分流比：40∶1；进样量：1μL。

1.2.5检出限及精密度实验吸取10mL牛奶，加入3mL 90μg/mL样品标准溶液，按1.2.3进行样品前处理，平行进样6次，计算相对标准偏差以评价方法的精密度；以样品中能检出糖醇的最低添加量为检出限。

1.2.6回收率及重现性实验精密吸取3mL 90μg/mL样品标准溶液加入到10mL牛奶中，按1.2.3进行样品前处理，平行实验6次，对方法的回收率和重现性进行考察。

2　结果与讨论

2.1三种糖醇乙酰化条件的确定

按1.2.2，考察了不同反应温度与反应时间对糖醇衍生化效果的影响。结果表明：三种糖醇衍生产物的峰面积随着乙酰化反应温度的升高、时间的增加而增加，当吡啶-乙酸酐（1∶1，V/V），反应温度为90℃，反应时间为30min时，三种糖醇衍生产物的峰面积趋于最大值，反应基本完全，产物较单一，准确度高，因此确定为最终衍生化条件。

2.2色谱条件的优化

为了确定色谱分离条件，实验比较了极性色谱柱：DB-FFAP（15m×250μm×0.25μm）和弱极性色谱柱：HP-5（30m×320μm×0.25μm）对三种糖醇衍生产物的分离效果。结果表明：DB-FFAP柱分离糖醇衍生物时，色谱峰不对称，分离度和重现性较差，影响定量，而HP-5柱能较好地将糖醇衍生物分离，重现性好，灵敏度较高（图1），所以本实验采用HP-5柱进行检测。

图1　糖醇标准品气相色谱图Fig.1　GC chromatogram of sugar alcohol standards

2.3前处理方法的优化

2.3.1蛋白质去除试剂浓度与添加量的选择实验分析了蛋白质去除试剂不同质量百分浓度与添加量对蛋白质沉淀效果的影响。结果（表1）表明：当试剂浓度为0.1%时，随着试剂添加量的增加，即试剂与牛奶体积比的增加，上清液未完全澄清。而当试剂浓度为0.3%、试剂与牛奶体积比为1∶1时，上清液已澄清，沉淀效果较好，便于乙酰化处理，从对牛奶中成分影响角度考虑，确定试剂浓度为0.3%，试剂与牛奶体积比为1∶1。

表1　蛋白质去除试剂不同浓度与添加量组合实验结果Table 1　Combination experiments of different concentration and adding quality of protein removal reagents

2.3.2蛋白质去除试剂的选择分别添加了270μg三种糖醇标准品的样品经锌盐和钡盐与经三氯乙酸两种方法处理后测得的谱图如图2和图3所示，平均加标回收率如图4所示。

图2和图3表明：两种方法都能净化样品，但加入与三氯乙酸同等浓度和体积的盐溶液沉淀效果更好，同时锌盐和钡盐对牛奶中成分的影响小于三氯乙酸，提高了样品的回收率。由图4看出，经两种方法处理后，阿拉伯醇、木糖醇平均加标回收率差异极显著（p＜0.01），通过盐处理的加标样品中糖醇回收率高于三氯乙酸处理的加标样品，其中木糖醇平均回收率相差7.10%。且三氯乙酸易潮解，不易定量称量，综合考虑盐处理效果优于三氯乙酸处理。

2.3.3样品干燥方法的选择分别添加了270μg三种糖醇标准品的样品经冷冻干燥与经旋转蒸发两种方法处理后测得的谱图如图5和图6所示，平均加标回收率如图7所示。

图2　加盐样品气相色谱图Fig.2　GC chromatogram by salt

图3　加三氯乙酸样品气相色谱图Fig.3　GC chromatogram by acetocaustin

图4　两种蛋白去除方法的平均加标回收率Fig.4　The average recoveries of two kinds of protein removal methods

图5　冷冻干燥气相色谱图Fig.5　GC chromatogram by freeze-drying

图6　旋转蒸发气相色谱图Fig.6　GC chromatogram by rotary evaporation

图7　两种干燥方法的平均加标回收率Fig.7　The average recoveries of two kinds of drying methods

图5和图6表明：经过两种干燥方法处理，峰面积差别明显，冷冻干燥后样品中糖醇的浓度高于旋转蒸发处理的样品。由图7看出，经冷冻干燥处理的样品中，三种糖醇平均加标回收率均高于旋转蒸发处理的样品（p＜0.01），其中木糖醇回收率相差11.09%。糖醇水溶性较好［8］，在水剧沸的同时，糖醇流失速度加快，回收率降低，而冷冻干燥在低温下将水分升华，且冷冻干燥可以批量处理样品，减小了误差，更适用于前处理中样品的干燥。

2.4方法学考察

2.4.1线性方程、检出限及精密度的测定按1.2.1，进行线性回归分析，得3种标准品的线性回归方程、相关系数和线性范围；按1.2.5考察方法的检出限及精密度。结果（见表2）表明：精密度实验的相对标准偏差在1.23%～2.12%之间，表明该方法具有较好的精密度。

2.4.2回收率及重现性的测定参照未加标准品牛奶中糖醇的含量水平，经检测，10mL牛奶空白样中阿拉伯醇、木糖醇未检测到，甘露糖醇含量为10.08μg。按1.2.6考察方法的回收率及重现性。结果（见表3）表明：三种糖醇回收率在91.17%～92.06%之间，表明气相色谱能较好测定糖醇的含量，但是由于在蛋白质沉淀和样品干燥过程中，少量糖醇随着蛋白质沉淀和水分的升华出现一定的损失，导致方法存在一定的系统性偏差，需要进一步研究；重现性实验的相对标准偏差在1.37%～2.04%之间，表明此方法具有较好的重现性。

表2　糖醇的线性方程、相关系数、线性范围、检出限和精密度Table 2　Linear equations，correlation coefficients，linear ranges，detection limits and precisions of sugar alcohols

表3　回收率和重现性实验Table 3　Average recovery and reproducibility of measured results

3　结论

确立了衍生化时间及温度、色谱分离条件，以乙酸锌和氢氧化钡除去牛奶中蛋白质，经冷冻干燥，利用毛细管气相色谱定量分析糖醇类强化型牛奶中阿拉伯醇、木糖醇、甘露糖醇的方法。研究结果表明该方法具有良好的精密度和重复性，操作简单，适于分析糖醇类强化型牛奶中糖醇类甜味剂的含量，为以后牛奶中糖醇的检测分析提供方法和理论依据。

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Study on pretreatment methods for the simultaneous determination of three kinds of sugar alcohols in milk by gas chromatography

CAO Yu-lin，SHU Tian-feng，LIU Yan-ling，XUE Xiu-heng*，MEI Lin，WANG Zhi-geng，SUN Guo-yan
（College of Tea and Food Science and Technology of Anhui Agricultural University，Anhui Agricultural Products Processing Engineering Laboratory，Hefei 230036，China）

A novel method was developed for the determination of sugar alcohol contents in milk by gas chromato-graphy after freeze-drying，and the external standard method was used to determine.After removal of proteinby zinc sulphate and barium hydroxide，the freeze-drying was used to dry samples.The sugar alcohols reacted withpyridine-acetic anhydride（1∶1，v/v）at 90℃ for 30min.The sugar alcohol acetate derivatives were analyzed by gas chromatography with HP-5（30m×320μm×0.25μm）and with a flame ionization detector.The results showed that the recoveries of sugar alcohols treated by freeze-drying was higher than rotary evaporation.Under the optional chromatographic conditions，the calibration curve was linear in the range of 10～90μg/mL（r=0.9974～0.9999）.The repeatability was reproducible（RSD=1.37%～2.04%）.The average recoveries were between 91.17%and 92.06%.This method was simple and fast so that it could be used to determine sugar alcohol contents in milk.

milk；sugar alcohols；freeze-drying；gas chromatography

TS252.7

A

1002-0306（2015）10-0069-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.005

2014－08－14

曹玉林（1990-），男，在读硕士研究生，研究方向：动物性食品加工与安全检测。

薛秀恒（1971-），男，博士，副教授，研究方向：动物性食品加工与安全检测。

安徽省自然科学基金项目（11040606M91）；安徽省实验区和试点省专项基金项目（12z0102055）。