BMP—7抑制H22荷瘤小鼠肿瘤组织PCNA表达并上调E—cadherin的表达

潘玉　丁芹　王莉娜　宋正霞　颜学兵

[摘要] 目的 探讨骨形态发生蛋白-7（bone morphogenetic protein-7， BMP-7）对H22荷瘤小鼠的抑制作用。 方法 该实验时间为2014年9月—2015年1月，选择清洁级昆明小鼠建立H22荷瘤小鼠模型，随机分成3组：生理盐水组、环磷酰胺组、BMP-7组。HE染色观察肿瘤组织病理学变化；免疫组织化学法检测肿瘤组织内增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen， PCNA）的表达；逆转录-PCR检测组织内E-cadherin的表达。 结果 HE染色显示BMP-7组有大片坏死，有明显的核碎裂、核溶解；环磷酰胺组细胞排列疏松，核质比例减小，瘤内有大片坏死。免疫组化显示BMP-7及环磷酰胺组PCNA的表达均低于生理盐水组 （F=34.78， P<0.05）。逆转录-PCR显示环磷酰胺组E-cadherin的表达最高，其次是BMP-7组，生理盐水组最低 （F=7.63，P<0.05）。 结论 BMP-7能下调H22荷瘤小鼠PCNA表达，并有上调E-cadherin表达的趋势。

[关键词] H22细胞；肝癌模型；BMP-7；PCNA

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2015）09（b）-0007-03

[Abstract] Objective To investigate the inhibitory effect of bone morphogenetic protein-7（BMP-7） on H22 tumor-bearing mice. Methods The experiment time is from September 2014 to January 2015. H22 tumor bearing mice model was established， and randomly divided into 3 groups： normal saline group， cyclophosphamide group and the BMP-7 group. The pathological histomorphology of transplanted tumor was observed under a light microscope after hematoxylin-eosin （HE） staining. The expressions of proliferating cell nuclear antigen （PCNA） were detected by immunohistochemistry. The expressions of alpha smooth muscle actin （alpha-SMA）， E-cadherin were detected by reverse transcription-PCR. Results It was found that BMP-7 group had large areas of necrosis and obvious karyorrhexis and karyolysis. The tumor cells of cyclophosphamide group arranged loosely， nucleo cytoplasmic ratio decreased， and the tumor tissue had large areas of necrosis. It was found that the expressions of PCNA in BMP-7 group and cyclophosphamide group were lower than those in normal saline group， the differences were statistically significant （F=34.78， P<0.05） by the immunohistochemistry. The expression of E-cadherin in the cyclophosphamide group was the highest， followed by the BMP-7 group， the normal saline group was the lowest（F=7.63， P<0.05）. Conclusion BMP-7 can decrease the expression of PCNA in H22 tumor-bearing mice， with the trend of upregulating the expression of E-cadherin.

[Key words] H22 cell； Hepatocellular carcinoma model； BMP-7； PCNA

骨形态发生蛋白-7（bone morphogenetic protein-7，BMP-7）可通过拮抗转化生长因子-β（transforming growth factor-β， TGF-β）/Smad信号通路发挥抗炎、抗纤维化作用，并有多项研究证实其抗肿瘤作用[1-3]。已有研究显示[4-5]BMP-7可通过拮抗TGF-β信号通路抗肝纤维化，而肝纤维化是由慢性肝炎发展至肝硬化、肝细胞癌的中间过程，因此BMP-7可能通过拮抗TGF-β信号通路，发挥抗肝细胞癌的作用。该实验时间为2014年9月—2015年1月。选择清洁级昆明小鼠建立H22荷瘤小鼠模型，探讨BMP-7对H22荷瘤小鼠的抑制作用， 现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 动物及瘤株 清洁级昆明小鼠，雄性，20～26 g，购自徐州医学院动物中心。小鼠肝癌细胞株H22由山东省医学科学院药物研究所肿瘤实验室惠赠。

1.1.2 主要试剂 重组人BMP-7购自美国Pepro Tech公司，HE染色试剂盒购自江苏碧云天公司，增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen， PCNA）一抗购自武汉三鹰生物工程有限公司，兔超敏二步法免疫组化检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，TIAN Script cDNA第一链合成试剂盒和2×PCR Master MIX购自天根生物科技有限公司。环磷酰胺购自江苏恒瑞医药股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 建立肿瘤模型、分组、给药 H22肝癌细胞采用小鼠腹水方式传代培养。无菌操作取H22小鼠腹水，台盼蓝染色，光镜下瘤细胞计数，活瘤细胞>95%，调整细胞浓度为l×107细胞/mL，分别取0.2 mL接种于小鼠右前肢外侧皮下，制成实体型荷瘤小鼠模型。将24只小鼠随机分成3组，分别是生理盐水组、环磷酰胺组、BMP-7组。各组于造模第二天开始给药。生理盐水组：生理盐水0.2 mL；环磷酰胺组：环磷酰胺25 mg/kg，约0.2 mL；BMP-7组：rhBMP-7 3 ng/kg，约0.2 mL，分别尾静脉注射，1次/d，连续14 d。

1.2.2 处死、取材 停药第二天，颈椎脱臼处死小鼠，完整剥离瘤体。各组肿瘤标本分别于4%多聚甲醛固定、RNA Store液处理。

1.2.3 荷瘤小鼠移植瘤组织病理形态学观察 肉眼观察各组小鼠的移植瘤大体形态。然后，取部分荷瘤小鼠移植瘤组织，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，制备4 μm厚切片，HE染色。光学显微镜下观察各组织的形态，以及肿瘤细胞生长、坏死及对周围组织的浸润情况。

1.2.4 荷瘤小鼠移植瘤组织中增殖细胞核抗原（PCNA）的表达 操作按兔超敏二步法免疫组化染色试剂盒说明书进行，一抗PCNA抗体用0.01 M磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS） l：200稀释后使用。阴性对照以PBS代替PCNA抗体。以细胞核染成棕黄色或棕褐色为阳性反应，染色的强弱代表组织中PCNA蛋白表达水平的高低。每个标本选取5个高倍视野（×400倍），应用Image-Pro Plus软件分析，计算每个视野下阳性染色的积分光密度（IOD）值及平均光密度（IOD/area）。

1.2.5 肿瘤组织总RNA提取及RT-PCR检测 按Trizol说明书抽提总RNA，紫外分光光度计测吸光度值（A值），吸光度比值（A260/A280） 1.8～2.0之间，RT-PCR按TIAN Script cDNA第一链合成试剂盒和2×PCR Master MIX说明书操作。采用Primer 5.0分析设计引物序列（表1），引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下观察电泳结果，并用凝胶成像系统扫描照相，Image J软件对图像进行分析。

1.3 统计方法

数据分析采用SPSS 16.0统计软件分析处理，计量资料用均数±标准差（x±s）表示；样本方差齐性采用levene法检验，方差齐时采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法；方差不齐时采用Kruskal-Wallis法检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 荷瘤小鼠的一般情况

在实验过程中，生理盐水组荷瘤小鼠活动减少，步态不稳，毛发稀疏，进食、进水量少，形体消瘦呈恶病质，其中2只小鼠在用药期间死亡，而环磷酰胺及BMP-7组小鼠病情相对于生理盐水组较轻，用药期间各有1只死亡。

2.2 荷瘤小鼠移植瘤组织病理形态学观察结果

肉眼可见荷瘤小鼠H22移植瘤体呈结节状，质嫩，剖面呈鱼肉状。HE染色显示肿瘤组织为未分化腺癌，生理盐水组肿瘤细胞排列紊乱，细胞密度大，核质比例大，核染色深且异型性明显，可见较多瘤巨细胞，肿瘤实质和间质分界不清；环磷酰胺及BMP-7组肿瘤细胞排列疏松，有纤维组织包裹，瘤细胞大小不一，核质比例减小，核呈圆形淡染，核仁小而不明显，瘤内出现片状坏死，肿瘤细胞周围可见淋巴细胞和巨噬细胞浸润（图1）。

2.3 BMP-7对肿瘤组织内PCNA表达的影响

PCNA蛋白表达定位于肿瘤细胞核内，呈棕黄色颗粒状。各组肿瘤组织均有阳性表达，其中生理盐水组PCNA表达最高，其次是环磷酰胺组，BMP-7组表达最低。环磷酰胺及BMP-7组PCNA的表达低于生理盐水组，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

2.4 半定量RT-PCR检测肿瘤组织内E-cadherin的表达水平

分别抽提各组肿瘤组织的总RNA，半定量RT-PCR检测E-cadherin的表达水平。结果使用Image J软件进行半定量分析，E-cadherin与β-actin的灰度值进行对比，得到E-cadherin电泳条带的相对灰度值。

从图2可以看出环磷酰胺组E-cadherin的表达最高，其次是BMP-7组，生理盐水组最低，差异有统计学意义（F=7.63，P<0.05），其中环磷酰胺组E-cadherin的表达与生理盐水组的差异有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

肝癌的治疗首选手术治疗，也可采用放射介入治疗，但是对于没有条件进行手术或者介入的患者没有确切有效的全身化疗方案。环磷酰胺虽然在体内实验中有明显的抑瘤作用，但在实际的临床应用中环磷酰胺对肝细胞癌的治疗效果基本上是否定的，且能产生明显的不良反应，一般不用于肝细胞癌的治疗，因此在该研究中环磷酰胺仅仅作为抗肿瘤药物的阳性对照。

BMP-7的基因工程产品早在2004年被FDA批准应用于临床脊柱融合手术，这说明rhBMP-7已进入临床应用阶段。已经有研究证实BMP-7能够通过拮抗TGF-β信号通路，发挥抗肿瘤作用[1-3]。同时，研究证实BMP-7可通过拮抗TGF-β信号通路抗肝纤维化[4-5]，而肝纤维化是由慢性肝炎发展至肝硬化、肝细胞癌的中间过程。有研究指出肝纤维化促进了致癌作用是由于成纤维细胞分泌gremlin阻断了BMP的功能，从而促进干细胞活化和增殖，导致肝细胞癌进展[6]。若能证实BMP-7拮抗肝细胞癌的作用，有广泛临床应用前景。

PCNA作为一项评估细胞增殖状态的指标，与恶性肿瘤的增长活性、转移及预后有密切关系。检测恶性肿瘤组织PCNA表达对判断肿瘤的恶性程度、预测淋巴结转移趋势、指导临床的治疗方案，以及改善患者预后均有重要意义。Lai JP等[7]研究显示在134例肝细胞癌中103例（77%）PCNA免疫组化染色为弥漫性强阳性，但是33例肝细胞腺瘤中仅2例（6%）阳性，而40例灶性结节性增生和77例大再生结节中，没有1例有此表现，提示PCNA可作为鉴别肝细胞癌与良性肝结节性病变的现有标志物的补充。还有研究[8]发现非编码反义RNA PCNA-AS1通过形成RNA杂交增加PCNA RNA稳定性，从而调节PCNA，进而促进肝细胞癌的肿瘤生长。该研究中BMP-7组H22荷瘤小鼠肿瘤组织中PCNA的表达明显低于生理盐水组，并低于环磷酰胺组，且实验过程中BMP-7组小鼠病情相对于生理盐水组较轻，提示BMP-7可下调PCNA表达，并有抑制H22荷瘤小鼠移植瘤组织增长的趋势。

临床观察发现绝大多数恶性肿瘤患者均死于肿瘤转移，而上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）被认为是上皮来源的恶性肿瘤发生侵袭、转移的重要原因，其主要特征有细胞黏附分子，如E-cadherin表达的减少，同时上调肌成纤维细胞标志物如波形蛋白、-SMA、纤连蛋白等。例如，宫颈癌患者[9]的肿瘤一旦转移至身体其他部位，预后明显变差，研究显示癌基因AEG1、Sam-68、FTS及miR-361-5p诱导宫颈癌的EMT，而肿瘤抑制因子LMX-1、SFRP1、klotho及 miR-155抑制宫颈癌的EMT，从而影响患者预后。EMT对卵巢癌[10]的腹膜转移以及无进展生存期和总生存期有至关重要的影响。在膀胱癌，Shh信号可通过激活EMT促进肿瘤发生。另外，EMT在乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌等多种癌症的原发性浸润与继发性转移中也起着非常重要的作用。

Duangkumpha K研究指出，BMP-7可以通过拮抗TGF-β诱导的EMT过程，抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭与转移[1]。另有研究显示，在胆管癌细胞中，BMP-7可以抑制N-cadherin的表达，上调E-cadherin表达，抑制EMT过程，从而抑制胆管细胞癌的转移[5]。Dorail T等[2]人发现姜黄素通过上调BMP-7的表达可以抑制前列腺癌骨转移。该研究结果显示给予BMP-7后细胞黏附分子E-cadherin的表达略高于生理盐水组，虽然差异无统计学意义，但是提示BMP-7有上调E-cadherin的表达，进一步提示BMP-7可能逆转H22肝癌细胞的EMT过程，从而发挥抗肿瘤作用。

该研究者先前研究[11]指出BMP-7在癌周组织中呈弥漫性或灶性表达，但在癌结节中表达甚少，这提示BMP-7表达减少可能是肝细胞发生癌变的重要因素之一。另外，体外研究[12]显示rhBMP-7可能通过磷酸化的Smad1/5/8信号通路明显减弱肝癌细胞株Huh7的迁移能力。结合该研究结果，进一步探讨BMP-7在肝细胞癌中的作用及其机制，可能寻找到肝细胞癌预防和治疗的新靶点。

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（收稿日期：2015-06-10）