经眼动脉灌注治疗兔成视网膜细胞瘤

张靖，姜华，陈昆山，李海波，蒋贻洲，林雀卿，李丹，黄晓明，肖湘生

·实验研究Experimental research·

经眼动脉灌注治疗兔成视网膜细胞瘤

张靖，姜华，陈昆山，李海波，蒋贻洲，林雀卿，李丹，黄晓明，肖湘生

目的评估兔成视网膜细胞瘤（retinoblastoma，RB）模型的建立及经导管眼动脉灌注（selective ophthalmic arterial injection，SOAI）治疗兔RB的可行性。方法HXO-Rb44RB细胞予中心细胞室培养，取对数生长期HXO-Rb44细胞，用PBS配成浓度为2.0×107个/ml的细胞悬液，抽取0.1 ml细胞悬液注射于6只SPF级新西兰兔右眼视网膜间隙下。接种肿瘤细胞前3 d和注射后1个月臀部注射环孢素A 15 mg·kg-1·d-1，1个月后减量至10 mg·kg-1·d-1并持续到实验结束。将RB兔分为对照组3只和实验组3只，对照组灌注0.9%氯化钠溶液15 ml，实验组将美法仑2.5 mg用0.9%氯化钠溶液稀释至15 ml后灌注。术后分别于7、14 d比较两组肿瘤生长情况。结果注射环孢素A期间，实验兔不良反应轻微，6只均建模成功。7次插管中6次成功插至眼动脉。SOAI术后1周，实验组肿瘤可见明显缩小，2周后均消失。SOAI术后，实验组仅1只见右眼轻度红肿、流泪，1周后红肿自行消退。结论SOAI治疗RB兔具有可行性，为进一步经眼动脉灌注治疗RB的基础研究提供了参考。

成视网膜细胞瘤；动物模型；经眼动脉灌注术；美法仑

【Abstract】ObjectiveTo investigate the establishment of retinoblastoma model in experimental rabbits，and to evaluate the feasibility and success rate of selective ophthalmic arterial perfusion of melphalan in treating retinoblastoma in experimental rabbits.MethodsThe human retinoblastoma HXO-Rb-44 cell line was cultured in the cell culture chamber with modified RPMI 1 640 medium containing 10%fetal bovine serum.The cell concentration in the suspension was 2.0×107cells/ml.The cell suspension of 0.1 ml was injected in the retinal gap of the right eye in six New Zealand rabbits.The rabbits were immuno-suppressed with daily intramuscular injection of cyclosporin A so as to prevent spontaneous tumor regression.The dosage schedule was 15 mg/kg per day for 3 days before cell inoculation and for 4 weeks thereafter，which was followed by 10 mg/kg per day for the last week of the experiment.The rabbits were randomly divided into study group（n=3）and control group（n=3）.Under general anesthesia selective ophthalmic arterial perfusion was performed in all the experimental rabbits.Melphalan（2.5 mg）was diluted with saline to prepare 15 ml solution and the solution was then injected in a pulse type into the rabbits of the experiment group，while only 15 ml saline was injected into the rabbits of the control group.The tumor growth condition at 7 and 14 days after the treatment was determined，and the results were compared between the two groups. ResultsDuring the period when the injection of cyclosporin A was used，the rabbits showed mild side effects.The retinoblastoma model was successfully established in all six experimental rabbits.Super-selectivecatheterization was performed 7 times，of which successful catheterization of ophthalmic artery was obtained in 6.One week after selective ophthalmic arterial perfusion of melphalan the tumor size was significantly decreased，and the tumor disappeared within 2 weeks.In the control group，swelling and tears of the right eye was observed in one rabbit，which spontaneously disappeared in one week.ConclusionFor the treatment of retinoblastoma in rabbits，selective ophthalmic arterial perfusion of melphalan is feasible.The results of this study provide useful reference for further research on ophthalmic arterial perfusion for retinoblastoma.（J Intervent Radiol，2015，24：146-149）

【Key words】retinoblastoma；animal model；selective ophthalmic arterial perfusion；melphalan

成视网膜细胞瘤（retinoblastoma，RB）是儿童最常见的眼内原发恶性肿瘤，全球发病率约为1/ 15 000～18 000，不治疗的病死率高达100%［1-3］。近年来发达国家通过开展常规眼科筛查，早期诊断治疗，RB患儿5年生存率已达87%～99%［4］。发展中国家RB患儿往往因发现明显白瞳或斜视才就诊，延误了早期治疗时机，病死率仍高达39%［5］。

2008年，Abramson等［6］使用微导管从股动脉穿刺进入到眼动脉，直接将化疗药物灌注到眼动脉，取得了显著的治疗效果。研究发现，该法到达眼球内的药物浓度是经静脉进入的10倍，且能够有效地降低眼球摘除率和患者因肿瘤转移导致的病死率［7-9］。随着经眼动脉灌注化疗技术（SOAI）治疗RB的应用，使部分眼球避免了摘除，但术后视力恢复不佳，可能与治疗后眼底血管病变有关。

动物模型是医学研究的一个重要工具。20世纪90年代已有转基因鼠的RB模型的报道［10］。但转基因鼠与人的眼睛体积差距较大，而且其股动脉较细，无法在鼠RB模型上实施SOAI术。2011年，有学者成功建立了兔RB模型［11］，本研究参照该方法建立了模型，并经眼动脉灌注美法仑治疗兔RB，观察SOAI技术用于动物模型的可行性，为进一步SOAI治疗RB的基础研究提供参考。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1实验材料新西兰兔6只由广东省医学实验动物中心提供，SPF级，雄性，体质量1.4～1.6 kg，均具有健康合格证。HXO-Rb-44 RB细胞由湖南医科大学提供。

1.1.2主要仪器及试剂CKX41型倒置显微镜（日本奥林巴斯公司）；311型恒温CO2孵箱（美国Thermo）；SW-CJ-2FD型超净工作台（苏州净化有限公司）；TDL-5-A型低速大容量离心机（上海安亭科学仪器厂）；DSA机（美国GE Innova 3100-IQ）。DMEM/F12培养液（批号NYF0890，Hyclone公司产品）；胎牛血清（批号91110002，GIBCO公司产品）；青/链霉素双抗（批号13013202，杭州吉诺生物医药有限公司产品）。

1.2方法

1.2.1兔RB模型的建立HXO-Rb-44 RB细胞由广东省医学实验动物中心细胞室培养。使用DMEM/ F12基础培养液加10%胎牛血清，培养皿中加入10 ml培养液。待细胞长至80%～90%融合时，弃去原培养液，PBS液洗涤2次，加入培养液，小心吹打细胞，1传3，传代细胞观察3 d。

新西兰兔于接种肿瘤细胞前3 d和注射后1个月均于臀部注射环孢素A 15 mg·kg-1·d-1，1个月后减量至10 mg·kg-1·d-1，并持续到实验结束。取对数生长期HXO-Rb44RB，用PBS配成浓度为2.0×107个/ml的细胞悬液，取0.1 ml细胞悬液注射6只新西兰兔右眼视网膜间隙，四环素可的松眼药膏涂眼。每日散瞳观察肿瘤生长情况，2周后进行超声检查。

1.2.2SOAI术治疗兔RB随机将RB实验动物分为对照组3只、实验组3只。于接种肿瘤细胞后2周，肌内注射0.2～0.3 ml/kg速眠新，麻醉后仰卧位固定，兔右侧股动脉根部皮肤常规脱毛消毒，切开皮肤分离暴露股动脉，行股动脉Seldinger穿刺，成功后置入4 F小儿血管鞘。在X线透视引导下，用4 F超滑Cobra导管（日本Terumo）选择性插入右侧颈内动脉。增强器转至90°，头颅影像呈侧位，采取人工手推对比剂（碘克沙醇）进行颈内动脉造影，眼动脉显影后予以路图，用ev3微导丝引导1.7 F ev3 45°微导管行眼动脉超选择性插管，造影确认后，行眼动脉灌注。对照组灌注0.9%氯化钠溶液15 ml，实验组将美法仑2.5 mg用0.9%氯化钠溶液稀释至15 ml后灌注。术毕，撤管后拔动脉鞘，压迫穿刺点5～10 min并依次缝合各层组织后用无菌纱布包扎，并预防性使用抗菌药物3 d。术后分别于7、14 d观察两组肿瘤生长情况。

1.3统计分析

2　结果

2.1兔RB模型的建立

实验兔在注射环孢素A期间主要的不良反应为齿龈肿大、垂涎、体质量下降，并至实验结束。注射肿瘤细胞7 d后，6只实验兔均可见肿瘤生长并持续增大。其中2只呈外生性生长（图1），将其分别纳入实验组和对照组。其余4只用间接检眼镜及超声检查可见视网膜肿瘤块状生长。

图1　肿瘤呈外生性生长

2.2SOAI术治疗兔RB结果

SOAI术插管中，5只成功插至眼动脉（图2），1只因眼动脉痉挛插管失败，2 d后行左侧股动脉穿刺并成功插至眼动脉。

图2　颈内动脉造影显示RB兔的眼动脉

SOAI术后1周，实验组肿瘤可见明显缩小，2周后均消失（图3、4）。对照组肿瘤持续生长，未见缩小。

SOAI术后，实验组仅1只见右眼轻度红肿、流泪，1周后红肿自行消退。实验组3只RB兔SOAI术后2周体质量由（1.5±0.2）kg下降至（1.2± 0.1）kg，对照组体质量由（1.5±0.1）kg下降至（1.3± 0.3）kg，两组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图3　超声示肿瘤治疗前后变化

图4　外生性肿瘤治疗前后变化

3　讨论

随着医疗水平的提高，RB的治疗模式发生改变，由挽救生命转向挽救患儿生命的同时保住眼球甚至视力，提高患儿的生活质量［12］。全身化疗联合一种或多种局部治疗（激光电凝术、冷冻、热疗）是近10余年来治疗RB的模式，使RB保眼治疗成为目标。虽然使用全身化疗联合局部治疗RB取得了良好的治疗效果，但是很多研究证实，单纯化疗结合局部治疗对于国际眼内RB分级标准（IIRC）D-E期患儿的疗效并不显著［13-14］，而且化疗的不良反应也较大。眼内期RB化疗过程中可出现暂时性脊髓抑制，永久的听力损伤和肾损害，加之潜在性的二次肿瘤的发生，尤其是白血病［15-16］。SOAI治疗RB有效，并发症少，甚至可以改善视力，但对于眼内晚期的RB，其保眼率依然达不到100%［17］，而且随着美法仑的不断应用，其眼底血管的并发症也越来越受到关注［18］。

2011年，兔RB模型的成功建立，使SOAI的动物基础研究成为可能。因兔的眼睛与小儿眼睛的体积具有可比性，既往也有对兔VX2肝移植瘤进行股动脉穿刺并经肝动脉灌注栓塞化疗的报道［19］，使超选择兔眼动脉成为可能。本实验正是基于兔RB模型的建立，初步探讨经眼动脉灌注美法仑治疗兔RB的可行性。

兔与裸鼠的区别在于兔具有自身免疫力，会影响RB肿瘤细胞的接种。为提高建模成功率，我们采用SPF级兔作为实验对象，其饲养环境干洁，对培养瘤种更适合，且肌注环孢素A，抑制了其自身免疫力，有利于肿瘤细胞的生长［20］。本实验中，兔RB模型的成功建立，其中有2只呈外生性生长，可能原因是未将肿瘤细胞种植于视网膜下，而是种植于巩膜下所致，但经SOAI术后肿瘤也发生消退，证明有药物到达肿瘤供养的血管内。

2004年，日本学者报道了SOAI治疗RB的技术［21］。该技术使用球囊导管阻碍颈内动脉穹窿上大脑供血，再经导管于球囊近端灌注化疗药，迫使化疗药大部分直接进入眼动脉，起到局部化疗的作用。因其该技术致使药物未能全部进入眼动脉，影响了疗效。2008年，超选择直接灌注眼动脉法的出现，提高了治疗效果。本实验，7次插管中6次成功。1只RB兔因眼动脉痉挛致使插管失败，2 d后行左侧股动脉穿刺并成功插至眼动脉。对此我们建议，应由有血管介入经验的人员进行操作，动作要轻柔，以提高技术成功率。

本研究存在的不足之处是样本量少，且肿瘤生长时间短，导致肿瘤体积小，所以只初步探讨经眼动脉灌注化疗在动物模型的可行性，为进一步深入的基础研究提供参考。

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Selective ophthalmic arterial perfusion of melphalan for retinoblastoma：an experimental study inrabbits

ZHANG Jing，JIANG Hua，CHEN Kun-shan，LI Hai-bo，JIANG Yi-zhou，LIN Que-qing，LI Dan，HUANG Xiao-ming，XIAO Xiang-sheng.Department of Radiology，Affiliated Changzheng Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200003，China

XIAO Xiang-sheng，E-mail：cjr.xiaoxiangsheng@vip.163.com

R774.1；R739.72

A

1008-794X（2015）-02-0146-04

2014-08-03）

（本文编辑：李欣）

10.3969/j.issn.1008-794X.2015.02.014

广州市科技和信息化局项目（2012J4100032）

200003上海第二军医大学附属长征医院放射科（张靖、肖湘生）；广州市妇女儿童医疗中心介入与血管瘤科（张靖、姜华、陈昆山、李海波、蒋贻洲、林雀卿、李丹、黄晓明）

肖湘生E-mail：cjr.xiaoxiangsheng@vip.163.com