酸性α-淀粉酶菌株的筛选及其发酵条件研究

屈建航尹伊焦国宝丁长河张倩屈凌波刘仲敏

（1. 河南工业大学生物工程学院，郑州 450000；2. 河南仰韶生化工程有限公司，渑池 472400）

酸性α-淀粉酶菌株的筛选及其发酵条件研究

屈建航1尹伊1焦国宝2丁长河1张倩1屈凌波1刘仲敏2

（1. 河南工业大学生物工程学院，郑州 450000；2. 河南仰韶生化工程有限公司，渑池 472400）

自淀粉厂周边土壤分离筛选到一株高效耐酸α-淀粉酶菌株SH3，初步鉴定为酵母菌，发酵粗酶pH范围3.8-8.0，最适作用pH5.0，该酶在80℃下仍有酶活，最适作用温度50℃。经单因素发酵条件的研究与优化，最适温度37℃，培养基初始pH5.0，可溶性淀粉作碳源，蛋白胨为氮源，200 mL装液量。正交试验确定最佳产酶条件为可溶性淀粉15 g/L、蛋白胨30 g/L、37℃、pH4.5，该条件下酶活力为96.8 U/mg。

耐酸α-淀粉酶；菌株筛选；发酵条件；工艺优化；酵母菌

α-淀粉酶可从淀粉分子内部切开α-1，4 糖苷键，生成糊精和还原糖，广泛应用于食品、酿造、制药、纺织及石油开采等诸多领域，在工业生产中有极其重要的地位，是目前用途较广泛的一种酶制剂［1，2］。目前工业应用的α-淀粉酶主要来源于细菌和丝状真菌［3，4］，在原始菌株中，真菌来源的α-淀粉酶被发现比细菌更稳定［5］。国外对酸性α-淀粉酶的研究起步较早，1963年日本Yasuji等［6］发现可用真菌生产酸性α-淀粉酶。在酵母菌中也发现了部分能产生高酶活α-淀粉酶的菌株［7］。我国对产α-淀粉酶菌株的研究起步较晚，尤其是耐酸性α-淀粉酶。目前，国际上一些大的酶制剂公司生产耐酸α-淀粉酶的菌种50%是基因工程菌［8］。近年来，已发现数十株优良产α-淀粉酶菌，包括耶鲁维亚酵母（Yarrowia）、类酵母（Aureobasidium）、毕赤氏酵母（Pichia）、假丝酵母（Candida）、红酵母（Rhotolorula）等［9］，对酵母菌应用于工业生产α-淀粉酶有了进一步推动［10］。本研究筛选出一株耐酸性α-淀粉酶酵母菌株，研究且优化其发酵条件，旨在为工业利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土壤样品 河南省偃师某面粉厂污水排出口处采集土壤样品。4℃保存备用。

1.1.2 培养基 筛选培养基（g/L）［1］：牛肉膏 3，蛋白胨 10，NaCl 5，可溶性淀粉 10，琼脂粉 15，pH 5.0。种子及发酵培养基（g/L）［11］：胰蛋白胨5，可溶性淀粉10，（NH4）2SO42.5，KH2PO43，CaCl20.2，pH调至5.0。

1.2 方法

1.2.1 酸性α-淀粉酶产生菌的分离筛选 初筛：土壤样品，10倍梯度稀释法涂布于筛选培养基，28℃恒温培养。滴加碘液，记录有透明圈的菌株。复筛：将初筛有透明圈的菌株，接种种子培养基，37℃、200 r/min培养12 h，以10%的接种量转至发酵培养基，相同条件培养24 h。发酵液5 000 r/min离心15 min，上清为粗酶液，测定酶活［1］。

1.2.2 淀粉酶活力测定方法 Yoo酶活测定法［12，13］稍加改进：2.5 mL 0.5%可溶性淀粉溶液与2.5 mL柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH5.0）50℃恒温水浴锅预热10 min，加入酶液0.5 mL，50℃下准确反应10 min，加入5 mL 0.1 mol/L的盐酸终止反应，取上述混合液0.5 mL与5 mL碘液混匀，660 nm测定吸光度值R（以2.5 mL蒸馏水代替可溶性淀粉溶液，其余条件相同作为空白）。在上述反应条件下，以0.5 mL的缓冲液代替0.5 mL酶液，测定吸光度值R0［11］。

酶活定义：50℃、pH5.0条件下，10 min水解1 mg淀粉所需的酶量为一个酶活力单位。

酶活公式：待测酶活（U/mg）=100*D*（R0-R）/R

其中，D：稀释倍数，R0：对照吸光值，R：酶液的吸光值，100：转换系数。

1.2.3 菌种ITS序列鉴定

1.2.3.1 分子试剂及引物 Taq mix（TaKaRa）、ITS4引物5'-3'：ggAAgTAAAAgTCgTAACAAgg、ITS5引物5'-3'：TCCTCCgCTTATTgATATgC。

1.2.3.2 基因系统发育鉴定 基因组总DNA的提取参考文献［14］进行。ITS序列PCR扩增反应体系：Taq mix 12.5 μL，ITS4 0.5 μL，ITS5 0.5 μL，ddH2O 9 μL，基因组DNA模板2.5 μL，总体积25 μL。反应过程：95℃ 5 min，30次循环（94℃ 30 s，55℃ 1 min，72℃ 1 min），72℃ 10 min。PCR产物测定核苷酸序列，GenBank数据库完成BLAST比对。

1.2.4 酶学性质研究 37℃、200 r/min培养48 h的发酵液上清作为粗酶，pH3.8、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0的缓冲条件，分别测定酶活以确定pH范围。设置30、37、45、50、55、60、70和80℃温度条件测定酶活以确定温度耐受性。

1.2.5 产酶发酵条件研究

1.2.5.1 菌株产酶曲线 种子液10 mL接种到100 mL发酵培养基，从3 h开始每小时测定酶活，以培养时间为横坐标，酶活力为纵坐标绘制产酶曲线。

1.2.5.2 温度对菌株产酶的影响 以5%的接种量将种子液接至100 mL发酵培养基，分别28、37、40℃振荡培养，从产酶高峰期开始每小时测定酶活。

1.2.5.3 初始pH对菌株产酶的影响 调节发酵培养基初始pH值为4.5、5.0、5.5、6.0，接入5%种子液，37℃、200 r/min培养，在产酶高峰期取样，测定酶活。

1.2.5.4 碳源对菌株产酶的影响 分别以0.5%葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉作为碳源，5%的接种量至100 mL发酵培养基中，37℃、200 r/min培养，在产酶高峰期测定酶活［15］。

1.2.5.5 氮源对菌株产酶的影响 分别以0.5%蛋白胨、棉籽饼、黄豆饼、牛肉膏作为氮源，5%的接种量至100 mL发酵培养基中，37℃、200 r/min培养，在产酶高峰期测定酶活。

1.2.5.6 装液量对菌株产酶的影响 在500 mL三角瓶中分别装入50、100、150、200 mL发酵培养基，接入5%的种子液，37℃、200 r/min培养，在产酶高峰期测定酶活。

1.2.6 正交试验 根据单因素优化实验结果，针对碳源、氮源、温度和pH，经SPSS软件设计四因素三水平正交实验［16］。

2 结果

2.1 菌株筛选

共筛选出产酸性α-淀粉酶的菌株24株，部分筛选结果见表1，其中初筛SH3菌株，透明圈/菌落直径比最大，D/d为5，选其作为实验菌株。

表1 菌种初筛结果

2.2 菌种鉴定

PCR扩增菌株18S ITS基因片段，测序后GenBank序列比对，结果与红酵母属（Rhodotorula sp.）的序列同源性最高，为97%（AM901697）-98%（NR073315），基本确定为酵母菌。

2.3 产酶曲线

产酶曲线见图1，由图1可见酶活先上升后下降，在14 h酶活达到91.4 U/mg，此后酶活迅速下降，12-15 h是高酶活时期。

图1 SH3菌株产酶曲线图

2.4 酶的pH和温度范围

50℃、不同pH下测定菌株SH3的α-淀粉酶活力，结果如表2所示。SH3所产淀粉酶活力受酸碱度影响较大，该酶在pH3.8-8.0之间均有酶活，在偏酸性条件下酶活力较高，pH5.0为酶反应最适pH，酶活为79.8 U/mg。

表2 酶的pH耐受范围

pH5.0、不同温度下测定SH3酶活力，结果由表3可知，该酶在30℃-80℃均有酶活，30℃-50℃酶活力随温度升高而升高，最适作用温度为50℃，酶活力为74.2 U/mg。

表3 酶的温度作用范围

2.5 产酶发酵条件优化结果

2.5.1 温度对菌株产酶的影响 28℃、37℃、40℃发酵条件下研究温度对菌株SH3产酶的影响，结果（图2）表明，37℃和40℃酶活均是先上升后下降，37℃酶活14 h达到最高91.6 U/mg，40℃酶活与37℃相比上升较快，13 h达到最高91.3 U/mg，但下降也较快。28℃菌体生长缓慢，高活性酶活出现较晚。可能随温度升高生长代谢加快，产酶高峰期提前。选取37℃作为最佳发酵温度。

图2 温度对产酶的影响

2.5.2 装液量对菌株产酶的影响 由图3可知，在发酵高峰期，相同时间内200 mL装液量的发酵酶活最高，14 h时达到最高88.2 U/mg。

2.5.3 初始pH对菌株产酶的影响 选取pH4.5、5.0、5.5、6.0的初始培养条件，分别测定SH3酶活力，结果（图4）表明，pH4.5-6.0条件下菌体均能生长，发酵14 h时测定酶活，pH5.0发酵条件下酶活最高，为89.7 U/mg，依次高于pH5.5、6.0和4.5，其中pH4.5发酵条件下酶活相对最低，为33.4 U/mg。

图3 装液量对菌株产酶影响

图4 初始培养基pH条件对产酶的影响

2.5.4 碳源和氮源对菌株产酶的影响 由表4可知，可溶性淀粉作为培养基碳源时酶活最高，为87.95 U/mg，葡萄糖作碳源时酶活最低。而氮源中蛋白胨为最佳氮源，酶活最高达到93.39 U/mg，棉籽饼作氮源时酶活最低，为53.82 U/mg。

表4 碳源和氮源对菌株产酶的影响

2.6 正交实验及结果

在单因素的基础上，对可溶性淀粉、蛋白胨、初始温度与pH四因素作三水平正交试验（表5）。由表6可知，最佳发酵条件为可溶性淀粉15 g/L、蛋白胨30 g/L、37℃、pH4.5，对应酶活最高为96.8 U/mg。极差分析结果可看出，碳源对菌株产酶的影响最大，影响程度依次为：可溶性淀粉＞蛋白胨＞pH＞温度。

表5 四因素三水平表

表6 正交实验结果及极差分析结果

3 讨论

酶α-淀粉酶是基于淀粉糖原料生产产品过程中使用的主要糖酶，在全球酶制剂产业中占30%左右［17，18］。传统α-淀粉酶最适作用pH值为5.8-6.2，而淀粉乳偏酸性（pH3.2-4.5），进一步糖化也是在酸性条件（pH4.2-4.5）下进行，即液化前后需两次调pH，影响产品提取，不利于节能减排。耐酸耐高温α-淀粉酶可有效解决这一问题，需求量越来越大，已在欧美等发达国家得到广泛应用，但菌种选育等核心技术也被国外跨国公司所垄断。我国缺乏高产菌株，尚不能自主生产。

现阶段筛选得到的产酸性α-淀粉酶菌株主要是芽孢杆菌和曲霉［20，21，22］，普遍存在产酶水平较低的问题，仍需在自然界筛选高酶活菌株，并进一步优化耐酸、耐高温性能。采用基因工程技术对功能基因进行定向改造，构建工程菌，是选育高产、高性能菌株的重要途径［19］。

4 结论

从土壤样品中分离到一株产酸性α-淀粉酶菌株SH3，该菌18S ITS序列与红酵母菌相似性97%。其酶活性最适作用pH5.0，最适作用温度50℃。最佳发酵条件为可溶性淀粉15 g/L、蛋白胨30 g/L、37℃、pH4.5，对应酶活力96.8 U/mg。

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（责任编辑 李楠）

Screening of a Strain Producing Acid-stable α-Amylase and Optimization of Its Fermentation Condition

Qu Jianhang1Yin Yi1Jiao Guobao2Ding Changhe1Zhang Qian1Qu Lingbo1Liu Zhongmin2
（1. College of Biological Engineering，Henan University of Technology，Zhengzhou 450000；2. Henan Yangshao Biochemical Engineering Company，Mianchi 472400）

A strain SH3 producing acid-stable α-amylase was isolated from the soil nearing a starch factory. It was preliminarily identified as yeast. The pH range of crude enzyme reaction was 3. 8-8. 0 with the optimum of 5. 0， and the activity of the enzyme was still available in the temperature of 80℃ with the optimum of 50℃. The optimization of single-factor fermentation revealed that the optimal condition for the enzyme production was 37℃， pH 5. 0， soluble starch as carbon source， peptone as nitrogen source and 200 mL liquid volume. Orthogonal test showed that the optimal fermentation condition was as soluble starch of 15 g/L， peptone of 30 g/L， 37℃ and pH4. 5， under which the enzyme activity was 96.8 U/mg.

acid-stable α-amylase；strain screening；fermentation condition；process optimization；yeast

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.028

2014-11-25

国家科技支撑计划项目（2013AA102101），国家自然科学面上基金项目（31370147），河南省高校青年骨干教师资助计划（2013GGJS-077），河南省高校科技创新团队（15IRTSTHN019）

屈建航，女，博士，研究方向：微生物学；E-mail：qjh_bata@163.com