食品中双歧杆菌计数LGC能力验证结果与分析

北京市药品检验所（北京市保健食品化妆品检验中心）（100035）王似锦 刘文杰 张光华 牛振东 井良义 江志杰 高春

北京市药品检验所（北京市保健食品化妆品检验中心）微生物室近些年参加了多项国内和国际的能力验证，均取得了满意的结果。此次，本室参加了由英国LGC（Laboratory of the Government Chemist政府化学家实验室）组织的食品成分及微生物检测（QSM-Quality in Microbiology PT）的第219轮第27号双歧杆菌的计数试验（27 Bifidobacterium），并获得了满意的结果。下面将本次能力验证的结果和分析汇报如下，希望可以供相关的检验、检测实验室和机构作参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器 HFsafe-1500生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司）；厌氧盒和厌氧产气袋（日本三菱瓦斯化学株式会社）；KB720型生化培养箱（德国宾得）；奥林巴斯BX61显微镜（日本奥林巴斯株式会社）。ABI Veriti PCR仪（美国应用生物系统公司）

1.2 样品 由LGC提供，西林瓶装冻干粉。

1.3 稀释液和培养基 稀释液：ISO 29981-2010[1]标准中规定的稀释液QSR液（Quarter-strength Ringer’s solution），该稀释液主要用于乳及乳制品的微生物检验。QSR液的配制方法及灭菌条件：氯化钠2.25g，氯化钾0.105g，氯化钙0.06g，碳酸氢钠0.05g，溶解于1000ml水中，调节pH值于灭菌过后在6.9±0.2，灭菌条件121℃，15min。

培养基：ISO 29981-2010[1]标准中规定的TOS琼脂培养基，使用前需添加莫匹罗星锂盐。该培养基中含的TOS为一种通过β-半乳糖甘酶水解乳糖得到的混合物，该混合物能够有效的促进双歧杆菌的生长[1][2]。食品安全国家标准GB4789.35-2010[3]中规定的改良MRS培养基，使用前添加莫匹罗星锂盐。培养基的配置和灭菌均按照标准中的规定进行。

附图1 双歧杆菌革兰氏染色镜检显微镜图

附表1 LGC能力验证双歧杆菌计数结果

附表2 双歧杆菌计数能力验证结果

2 方法

2.1 双歧杆菌计数

2.1.1 稀释液的制备 按照LGC提供的作业指导书进行操作，取QSR液10 mL加入供试品西林瓶中，充分振摇，室温放置60min，作为10g供试品。取10g供试品，加QSR液90 mL充分振摇作为1∶10的均匀稀释液，取1∶10稀释液1mL，置上述缓冲液9 mL中，即为1∶102的稀释液，以此类推，制成1∶104的稀释液。

2.1.2 双歧杆菌计数 分别吸取1∶104、1∶103、1∶102及1∶10稀释液各0.1ml分别置于添加了莫匹罗星锂盐的改良MRS琼脂平板或添加了莫匹罗星锂盐的TOS琼脂平板上，用L形棒进行表面涂布，平行2份，同时分别取0.1ml稀释液同法操作，作为空白对照，置37℃厌氧培养72小时，计数。以上操作分别重复3次。

2.2 双歧杆菌的鉴定16S rDNA基因测序鉴定方法 采用快速DNA提取检测试剂盒提取DNA，利用细菌16S rDNA通用引物27f 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’1492r：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’进行PCR扩增。反应体系： PCR MasterMix 20μl，纯化水16μl，引物27f 1μl，引物1492r1μl，模板2μl。PCR扩增反应程序：94℃预变性4 min，之后的35个循环包括94℃ 预变性30 sec，55℃“退火”30sec，72℃延伸1min。35个循环后72℃延伸5min，最后4℃保存备用。扩增得到的PCR产物直接送到公司测序，测序由北京三博远志生物技术有限责任公司完成。测序结果经NCBI数据库比对。

3 结果与讨论

3.1 双歧杆菌的计数结果 由附表1可知，添加莫匹罗星锂盐的TOS琼脂培养基的结果为2700cfu/g，略高于添加莫匹罗星锂盐的MRS琼脂培养基2500cfu/g的结果。而且，同样培养48h后观察结果，TOS培养基培养中生长的菌落较大，而MRS培养基中生长的菌落较小，需要延长培养时间至72h。选择添加了莫匹罗星锂盐的TOS琼脂培养基的结果2700cfu/g为最终提交结果。

3.2 双歧杆菌的鉴定结果 选取TOS培养基上的典型的单菌落，划线于TOS培养基上，于37℃厌氧培养72h，进行革兰氏染色、镜检，结果见附图1。该菌为革兰氏阳性杆菌，成棒状，略弯曲。通过16SrDNA基因序列的鉴定方法，得到该菌的鉴定结果为短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）。

3.3 双歧杆菌计数能力验证结果的反馈 结果提交约50天后，LGC将此次能力验证结果返回，详细结果见表2。

Z值：由能力验证的指定值和能力评定标准差计算的偏倚的标准化度量。Z值的计算公式为：

其中，X为添加量（理论真值），x为本实验室结果，SDPA（Standard deviation for proficiency assessment）为能力评定标准差，该值由组织者提供。|Z|≤2为结果满意，2＜|Z|＜3为问题结果，|Z|≥3为不满意结果。

由附表2可知，本实验室此次能力验证采用添加莫匹罗星锂盐的TOS培养基，37℃培养的方法，结果为2700cfu/g，Z值为0.37，为满意结果，其中LGC给出的添加量（理论真值）为2000cfu/g。

4 结论

含有双歧杆菌的微生态调节剂作为食品或保健食品被广泛使用，这类产品的质量与其中含有的双歧杆菌的数量直接相关，因此，双歧杆菌数一般认为是检验这类产品的指标性成分[4]。但是，双歧杆菌的培养需要较高的营养条件和较严格的厌氧环境，因此，双歧杆菌计数的检验能力就显得尤为重要。

北京市药品检验所（北京市保健食品化妆品检验中心）微生物室通过参加英国LGC组织的食品成分及微生物检测（QSM-Quality in Microbiology PT）的第219轮第27号双歧杆菌的计数试验（27 Bifidobacterium），取得了满意的结果（Z=0.37）。微生物室通过此次国际能力验证，提高了双歧杆菌计数的检验能力，再次证明了培养基、环境以及人员等各系统能够保证出具科学有效可靠的数据，在加强能力建设的道路上又迈出了坚实的一步。