三七总皂苷对脑缺血-再灌注损伤大鼠脑神经的保护作用及机制*

陈杰，袁捷，韩祖成，曹姻莉

（1.陕西省中医医院，陕西西安710003；2.西电公司西安高压开关厂医院，陕西西安710077）

三七总皂苷对脑缺血-再灌注损伤大鼠脑神经的保护作用及机制*

陈杰1，袁捷1，韩祖成1，曹姻莉2

（1.陕西省中医医院，陕西西安710003；2.西电公司西安高压开关厂医院，陕西西安710077）

目的探讨三七总皂苷对脑缺血-再灌注损伤大鼠脑神经的保护作用及作用机制。方法选取60只SD雄性大鼠，按随机数字表法将其分为假手术组（A组）、模型组（B组，线栓法建立大鼠大脑中动脉局灶缺血-再灌注损伤模型后，腹腔注射生理盐水）、三七总皂苷组（C组，造模后，腹腔注射三七总皂苷100mg/kg），各20只。结果与A组相比，B组、C组神经症状评分、脑梗死体积均明显增高（P<0.05），依文思蓝、白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量均明显提高（P<0.05）；与B组相比，C组神经症状评分、脑梗死体积均明显降低（P<0.05），依文思蓝、IL-1β、TNF-α含量均明显减少（P<0.05）。结论三七总皂苷通过降低脑部细胞因子的表达、减少血脑屏障通透性，发挥对脑缺血-再灌注损伤大鼠的脑神经保护作用。

三七总皂苷；脑缺血-再灌注损伤；大鼠；保护

脑卒中后中枢神经系统功能恢复的治疗药物，一直是心脑血管学科研究的重点。大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤的病理状态与人类较相似，故模型常用于该领域研究［1］。三七为传统活血化瘀中药，具有散瘀止血、消肿定痛之功效，被广泛应用于脑血管疾病的治疗［2］。三七总皂苷（PNS）作为三七的主要活性成分，不仅有抗自由基作用，还能降低血液黏度、扩张血管、改善微循环、抗动脉粥样硬化等［3］。本研究中探讨了三七总皂苷对脑缺血-再灌注损伤大鼠脑神经的保护作用及作用机制，为临床防治脑血管疾病提供参考，现报道如下。

1　材料与方法

1.1动物、试药与仪器

60只SD雄性大鼠，体重260～300 g，平均（283.4±21.5）g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，合格证书号为医动字第08-005号。三七总皂苷（昆明制药集团股份有限公司，批号为100706）；甲酰胺（天津外环化工公司，批号为20100912）；2%四氮唑红（TTC，Sigma公司，批号为066K0698）；依文思蓝（Fluka进口分装，批号为050602）；白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）试剂盒购自Sigma公司。低温常速离心机（法国CR-412型），721型分光光度计（上海第三仪器厂）；EB-2800-22型电子天平（日本）；计算机图像分析系统（上海医科大学）。

1.2造模及给药方法

栓线制备：应用日本株式会社的尼龙线（直径0.25 mm），剪成6.5 cm长，将前端热塑呈光滑圆钝状，直径约0.3 mm，并在距离前端1.8 cm处做好标记。

脑缺血-再灌注损伤模型建立［4］：将60只SD雄性大鼠按随机数字法分为假手术组（A组）、模型组（B组）、三七总皂苷组（C组），各20只。大鼠经10%水合氯醛（3.5mL/kg）麻醉后，仰卧位固定，分离左侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉，并结扎颈外动脉及左侧颈总动脉，于颈内动脉远心端动脉夹夹闭后，迅速在距离颈外动脉与颈内动脉分叉处0.5 cm的颈总动脉处做切口，插入前端圆钝的尼龙线，插入深度约1.8 cm，造成大鼠大脑中动脉阻塞，使其形成脑缺血。于结扎入口处，尼龙线外留1 cm，缝合皮肤，术后2 h轻轻提拉外留线头，直至略感阻力，从而造成大脑中动脉再灌注。于缺血2 h及再灌注22 h，使用电热毯维持大鼠肛温在37℃左右。A组分离颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉，操作同前，但不结扎左侧颈总动脉。

给药处理：C组于缺血前15 min、缺血后6 h，经腹腔注射给予100 mg/kg三七总皂苷，A组、B组均经腹腔注射给予等量生理盐水。

1.3手术处理及观察指标

手术中B组及C组各死亡2只，成功造模36只，A组无死亡。观察和比较各组神经症状评分、脑梗死体积，以及脑组织中依文思蓝、IL-1β及TNF-α含量。

神经症状评分［5］：待大鼠麻醉苏醒后，将其放回鼠笼，术后24 h，根据5分制评分标准，进行神经症状评分，其中无神经损伤症状为0分，不能完全伸展健侧前爪为1分，向健侧转圈为2分，向健侧倾倒为3分，不能自发行走、意识丧失为4分。

脑梗死体积测定：脑缺血2 h、再灌注22 h后，断头取脑，将脑组织切成2mm厚度，在距离额极1，3，5，7mm处，冠状切开大脑，在37℃下，将脑切片浸入2%四氮唑红染色，染色30 min后取出，置入10%甲醛固定，24 h后拍照，利用图像分析系统，计算梗死面积，各脑片梗死面积与厚度的乘积累加获取梗死体积。

脑组织依文思蓝含量测定：取脑前30 min，10%水合氯醛麻醉下，左心室生理盐水灌注，直至流出液为无色，右侧股静脉注入2%依文思蓝，每只约注入1mL，摘取并精确称量脑组织湿重，投入中号试管，加入3 mL甲酰胺，45℃加盖水浴箱孵育48 h，轻摇、离心15min（3 000 r/min），取上清，于632 nm波长下，检测其吸光度。

IL-1β及TNF-α含量测定：术后24 h处死大鼠，冰盘上快速剥离脑组织，冷PBS缓冲液冲洗，滤纸吸干后，天子天平称重，制成10%脑组织匀浆，4℃离心15min（4 000 r/min），取上清液，利用双抗体夹心法，于492 nm波长下检测。

1.4统计学处理

2　结果

结果见表1和表2。B组大鼠于缺血后2 h、再灌注22 h，均出现手术对侧前肢内收、肌张力降低、肩抗力下降、向健侧倾倒的偏瘫症状。术后24 h，B组和C组大鼠出现不同程度的脑梗死灶。

3　讨论

本研究中采用大鼠大脑中动脉缺血-再灌注损伤模型，结果显示，与A组相比，B组和C组神经症状评分、脑梗死体积均明显增高，依文思蓝、IL-1β及TNF-α含量均明显提高（P<0.05），表明缺血-再灌注损伤模型建立成功；与B组相比，三七总皂苷组神经症状评分、脑梗死体积均明显减少（P<0.05），表明三七总皂苷对缺血-再灌注损伤模型大鼠脑神经具有保护作用。

表1　各组大鼠神经症状评分及脑梗死体积比较（±s）

表1　各组大鼠神经症状评分及脑梗死体积比较（±s）

注：与A组相比，*P<0.05；与B组相比，#P<0.05。下表同。

组别A组（n=20）B组（n=18）C组（n=18）剂量（mg/kg）--100神经症状评分（分）0 2.7±0.8*1.6±0.5*#脑梗死体积（mm3）0 124.7±18.4*66.5±12.3*#

表2　各组大鼠脑组织中依文思蓝、IL-1β及TNF-α含量比较（±s）

表2　各组大鼠脑组织中依文思蓝、IL-1β及TNF-α含量比较（±s）

组别A组（n=20）B组（n=18）C组（n=18）剂量（mg/kg）--100依文思蓝（μg/100mg）10.1±3.2 62.9±9.4*42.3±7.2*#IL-1β（pg/mL）37.8±6.5 56.9±9.4*37.6±7.3#TNF-α（pg/mL）54.3±7.1 90.5±9.2*56.1±8.4#

脑缺血-再灌注损伤可表现为脑细胞肿胀、自由基损伤等，甚至引发脑细胞凋亡，但其作用机制目前尚不清楚［6］。血脑屏障通透性变化是脑缺-血再灌注损伤的重要病理基础［7］。依文思蓝是常见的血脑屏障指示剂，能与血浆蛋白结合，正常情况下，不能通过血脑屏障，当脑缺血-再灌注损伤时，血脑屏障的通透性发生变化，依文思蓝就会通过血脑屏障，导致脑组织中的依文思蓝含量增加［8］。本研究中，与A组相比，C组神经症状评分、脑梗死体积均明显减少，大鼠脑组织中依文思蓝含量明显降低（P<0.05）。结果表明，三七总皂苷能减少血脑屏障的通透性，从而发挥对脑神经的保护作用。

脑缺血灶会伴有大量细胞因子表达及炎性细胞浸润，继而加重脑组织损伤，尤其是缺血-再灌注时更为严重。脑缺血后血浆及脑组织中IL-1β及TNF-α含量会出现急速增高，并随着时间延长，其水平会相应增高。IL-1β通过诱导白细胞粘附，介导白细胞向缺血灶浸润，引发炎性反应，加重脑组织损伤［9］；IL-1β及TNF-α等细胞因子通过炎症细胞活化，从而破坏血脑屏障的通透性；TNF-α通过对毛细血管的直接毒性作用，增加毛细血管的通透性，继而开放血脑屏障，还可造成内皮细胞损伤，增加基质金属蛋白酶表达，与IL-1β发挥协同作用，共同破坏血脑屏障的通透性［10］。本研究中，与B组相比，C组大鼠脑组织中IL-1β及TNF-α含量均明显减少（P<0.05），表明三七总皂苷能减少炎性细胞因子表达，降低血脑屏障的通透性，从而发挥对脑缺血-再灌注损伤大鼠的脑神经保护作用。

［1］董晓华，张成龙，吴志刚，等.三七皂苷R1对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用［J］.中国老年学杂志，2015，35（7）：1 940-1 942.

［2］郭元日.三七有效成分的药理学研究进展［J］.中国药业，2012，21（4）：86-87.

［3］陶录玲，刘轲.中药单体对脑缺血再灌注损伤保护的实验研究进展［J］.时珍国医国药，2012，23（12）：3 107-3 109.

［4］Zhou Y，Li HQ，Lu L，et al.Ginsenoside Rg1provides neuroprotection againstblood brain barrier disruption and neurological injury in a ratmodel of cerebral ischemia/reperfusion through downregulation of aquaporin 4 expression［J］.Phytomedicine，2014，21（7）：998-1 003.

［5］方道硕，彭明勇.三七总皂苷联合牛磺酸对脑缺血再灌注损伤模型大鼠的保护作用［J］.中国药房，2013，24（47）：4 436-4 438.

［6］马立，吴明华，梁森，等.三七总皂苷对脑缺血后神经血管的保护机制［J］.吉林中医药，2013，33（7）：720-723.

［7］王树林，安芳.中药对脑缺血再灌注损伤保护作用及机制研究进展［J］.神经药理学报，2014，4（3）：39-48.

［8］唐倩妹，裴清华.三七总皂苷对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护机制研究［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17（15）：210-213.

［9］尚远宏，徐晓玉.中药及其提取物对脑缺血保护作用的实验研究进展［J］.中国中药杂志，2013，38（8）：1 109-1 115.

［10］王海芳.三七总皂苷保护脑缺血再灌注脑损伤机制的实验研究进展［J］.山西中医学院学报，2014，15（2）：73-75.

Neuroprotective Role and M echanism Research of Panax Notoginseng Saponins on Cerebral Ischem ia Reperfusion Injury in Rats

Chen Jie1，Yuan Jie1，Han Zucheng1，Cao Yinli2
（1.Shaanxi Provincial Hospital of TCM，Xi′an，Shaanxi，China 710003；2.Xi′an XD High Voltage Apparatus Co.，Ltd.Hospital，Xi′an，Shaanxi，China 710077）

Objective To study the neuroprotective role and mechanism research of panax notoginseng saponins（PNS）on cerebral ischemia reperfusion injury in rats.M ethods 60 male SD rats were randomly divided into the sham operation group（group A），model group（group B，ip with normal saline after ischemia reperfusion injury by ligation of middle cerebral artery）and the PNS group（group C，ip with 100 mg/kg PNS after model establishment），20 rats per group.Results Compared with the group A，the neurological deficits scores and brain infarct size in the group B and group C were significantly increased（P<0.05）；and the content of Evans blue was obviously improved in group B and group C（P<0.05）；compared with group B，the neurological deficits scores and brain infarct size were significantly decreased（P<0.05）and the contents of Evans blue，IL-1β，TNF-αwere obviously reduced in group C（P<0.05）. Conclusion PNS can play the neuroprotective role on cerebral ischemia reperfusion injury in rats by decreasing the expression of cytokines in brain tissue and reducing the permeability of blood brain barrier.

panax notoginseng saponins；cerebral ischemia reperfusion injury；rats；protection

R285.5；R282.71

A

1006-4931（2015）24-0023-03

陈杰，男，主治中医师，研究方向为脑血管病，（电子信箱）657292134@qq.com。

2015-08-14）

*陕西省中医管理局科技攻关项目，项目编号：Ic86。