冰冻血样的DNA提取方法比较

黄旭颖 李剑平

（辽宁省沈阳中心血站，辽宁 沈阳 110044）

冰冻血样的DNA提取方法比较

黄旭颖 李剑平

（辽宁省沈阳中心血站，辽宁 沈阳 110044）

目的 探索冰冻血样的最佳提取方法，保证DNA检测分析的质量。方法 采用离心柱法和磁珠法进行DNA提取，分析所得DNA的浓度和纯度。结果 两种DNA提取方法提取DNA纯度均符合实验要求（1.6～1.9），两种方法无统计学差异；磁珠法提取冻存血样所得DNA浓度高于离心柱法，有统计学意义。结论 对于冰冻血液的DNA提取，磁珠法优于离心柱法。

冰冻血；DNA提取；方法；比较

从全血中提取基因组DNA是许多分子生物学实验的基础。DNA的纯度和浓度直接影响HLA分型结果的准确性。不同的检测技术对DNA材料的量要求不同[1]。中国造血干细胞捐献者资料库的HLA基因分型工作所采用的全血血样，有时是新鲜血样提取，绝大多数都是冰冻血样。血样存储时间越长，提取出的DNA含量就越低[2]。本实验室就冰冻血样采用离心柱法和磁珠法提取基因组DNA，以确定哪种方法更适合冰冻血样的提取。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1标本：均来自造血干细胞捐献者血样100份。EDTA抗凝血3～5 mL，-60 ℃冷冻保存3年，DNA提取时使用全血200 μL。

1.1.2试剂：血液基因组DNA提取试剂盒（离心柱型），天根生物技术科技有限公司生产；血液基因组DNA提取试剂盒（磁珠法），TBG公司生产。

1.1.3仪器：离心柱法使用德国生产的HERMLE Z323高速离心机和HH•W21•600型电热恒温水箱，磁珠法使用Ezbead System-32型提取仪（产地：台湾），基因组DNA含量和纯度检测使用Merinton SMA4000核酸蛋白测定仪。

1.2方法

1.2.1离心柱法：取血液样品200 μL，加入20 μL蛋白酶K溶液混匀，加入200 μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，56 ℃放置10 min，其间颠倒混匀数次；加200 μL无水乙醇充分颠倒混匀；将所得溶液加入一个吸附柱中，13400 g离心30 s弃废液；向吸附柱中加入500 μL缓冲液GD，离心弃废液；向吸附柱中加入600 μL漂洗液PW，离心弃废液；向吸附柱中加入600 μL漂洗液PW，离心弃废液；将吸附柱转入1.5 mL离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加70 μL洗脱缓冲液TB，离心2 min，将溶液收集到离心管中。

1.2.2磁珠法：使用96孔深孔板，在第1及7列加入裂解液800 μL，第2及8列加入洗液1 1000 μL、磁珠80 μL，第3及9列加入洗液1 1000 μL，第4及10列加入洗液2 1000 μL，第5及11列加入洗液2 1000 μL，第6及12列加入洗脱液150 μL；将200 μL全血样本对应加入标识的深孔板的第1及7列孔中；将反应板置于Ezbead System-32中加热组件滑槽内，点击运行程序；程序运行结束后取出反应板，将第6及12列的DNA移至洁净的离心管中。

1.2.3DNA浓度和纯度检测：SMA4000微量分光光度计预热30 min，选择SMA4000模块，清洗检测平台，点击Nucleic Acid程序，2 μL蒸馏水做空白对照，2 μLDNA进行纯度（A260nm/A280nm）和浓度（ng/μL)的测定。

2　结 果

图1　两种方法提取DNA浓度比较

图2　两种方法提取DNA纯度比较

见表1。用SPSS16.0软件对数据进行统计学分析，磁珠法提取冰冻血样所得DNA的浓度高于离心柱法，有统计学意义；而磁珠法和离心柱法提取DNA 的纯度均符合实验要求（1.6～1.9），无统计学差异。具体见图1和图2。提取的DNA已用于进行HLA基因分型，成功地进行了分型。

表1　两种方法提取DNA浓度和纯度的比较

3　讨 论

分子生物学实验中常用的DNA提取方法有胍盐酸法、盐析法、离心柱法、磁珠法等。核酸纯化是分子生物学的基础实验，核酸得率、纯度及可重复性是评估核酸纯化效果的重要指标[3]。

离心柱法采用了可以特异性结合DNA的离心吸附柱，提取血液中的基因组DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料能高效、专一吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。使用200 μL血样提取时不需要裂解，提取新鲜血样效果好，已在本室应用多年。

磁珠法提取DNA时，首先对血样进行了裂解，被裂解的全血中加入磁珠后，磁珠在裂解液的作用下表面的硅离子带上正电荷，特异性地吸附带有负电的核酸，但带有正电的蛋白质和不带电的其他杂质仍然留在溶液中[4]。提取仪程序设置使磁棒有无磁性以达到吸附或洗脱磁珠的原理，使吸附到磁珠表面的核酸通过裂解、洗涤以获得纯化的核酸模板。提取仪提取DNA操作简便、快速，对于中国造血干细胞捐献者资料库的冰冻血样，有明显的优势。

[1]段莹，于卫建.-40℃条件下储存不同时间的全血对提取DNA浓度的影响[J].中国输血杂志，2011，24（11)：973-974.

[2]朱建立，李晓天，温战迎，等.两种提取人血凝块基因组DNA方法的比较[J].山东医药，2013，53（19)：33-35.

[3]王大明，唐斯，邹红岩，等.自动工作站提取基因组DNA方法的建立及其在HLA基因分型中的应用[J].现代医学检验杂志，2007，22（3)：1-3.

[4]王大明，邹红岩，李桢，等.全血反复冻融对工作站提取基因组DNA的影响[J].现代医学检验杂志，2009，24（3)：96-98.

R446.9

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1671-8194（2015）25-0058-01