杏鲍菇多糖的单糖组成分析及其抗氧化活性研究

罗懿洋，任道远，陈丽芳，杨兴斌

（教育部药用资源与天然药物化学重点实验室陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安710119）

杏鲍菇多糖的单糖组成分析及其抗氧化活性研究

罗懿洋，任道远，陈丽芳，杨兴斌*

（教育部药用资源与天然药物化学重点实验室陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安710119）

采用水提醇沉法提取杏鲍菇多糖，通过苯酚-硫酸法测定多糖总含量，利用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生化高效液相色谱（HPLC）分析单糖组成。在体外抗氧化评价体系研究杏鲍菇多糖的总还原力及对DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基清除活性。其多糖的总糖含量达62.9%，分别由D-甘露糖、D-核糖、D-鼠李糖、D-葡糖醛酸、D-葡萄糖、D-木糖、D-半乳糖、D-岩藻糖组成，其相对摩尔百分比分别为9.8%、1.6%、0.15%、0.8%、62.8%、0.05%、24.4%、0.4%。结果表明，杏鲍菇多糖是一种典型的杂多糖，具有较强的抗氧化活性。

杏鲍菇，多糖，单糖组成，HPLC，抗氧化

杏鲍菇（Pleurotus eryngii），隶属于真菌门，担子菌亚门，真担子菌纲，伞形目，侧耳科，侧耳属，它是欧洲南部、非洲北部以及中亚地区高山、草地、沙漠地带的一种品质优良的大型肉质菌［1］。杏鲍菇具有菌肉肥厚、质地脆嫩、口感极佳的特点，其口味兼具杏仁香味和鲍鱼风味，非常适合食用［2］。现代药理学研究表明，杏鲍菇中所含的真菌多糖能增强肌体免疫功能，具有抗病毒，降低机体胆固醇，防止动脉硬等功能［3］。据文献资料介绍杏鲍菇子实体入药有降血压、血脂之功效，其多糖含量丰富，与双歧杆菌结合有改善肠胃功能和美容效果，多糖还具有抗癌效果。多项研究表明，过多的自由基会直接损害核酸、蛋白质、脂类，导致各种炎症、变态性疾病、癌症、衰老等一系列病变发生［4］。因此，多糖在生命科学领域的研究具有极高的推广开发价值。多糖化合物广泛存在于植物当中，具有多种保健功能，是当今功能性食品的研究热点。目前有关杏鲍菇的栽培已有报道，但是对杏鲍菇多糖的报道甚少，基于上述原因，本文分离提取杏鲍菇多糖并对其单糖组成和抗氧化活性进行测定。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

杏鲍菇 当地超市；无水乙醇、浓硫酸、苯酚、KH2PO4天津市天力化学试剂有限公司；葡萄糖、铁氰化钾、FeSO4、三氯乙酸（TCA）、FeCl3天津市富晨化学试剂厂；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、氯化硝基四氮唑蓝（NBT）、甲基吩嗪甲基硫酸盐（PMS） Wako公司；D-甘露糖、D-核糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-木糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖和D-岩藻糖 美国Sigma公司；三氟乙酸（TFA）、三乙胺（TEA） 德国Merck公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP） 北京化学试剂公司；色谱甲醇和乙腈 美国Honeywell公司；水杨酸 天津市登封化学试剂厂；H2O2天津市东丽区天天化学试剂厂；实验用水 为蒸馏水和超纯水。

752N紫外可见分光光度计 上海精科；RE-2000A旋转蒸发器、SHB－Ⅲ循环水多用真空泵 上海比朗仪器有限公司；LD4-2低速离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；KQ-300DE型数控超声波清洗器 昆山超声仪器有限公司；EZ-DRY冷冻干燥设备、HH-6B数显恒温水浴锅 巩义市予华仪器有限责任公司；SL202N型药物电子天平 上海明桥精密科学仪器有限公司；透析袋 华美生物工程公司；FZ102微型植物粉碎机 黄骅市中兴有限责任公司；超纯水仪 M ILLI-Q M ILLIPORE公司；RE-52AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 杏鲍菇多糖的提取 参考何念武［5］水提醇沉方法提取出杏鲍菇多糖并进行冷冻干燥。

1.2.2 糖含量的测定 苯酚-硫酸法［6］测定多糖总含量。多糖在浓硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定其吸光值，以标准葡萄糖浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标制作出标准曲线，将样品吸光值带入回归方程得到杏鲍菇粗多糖中的单糖浓度，即可得到该多糖的糖含量。

1.2.3 HPLC分析杏鲍菇多糖的单糖组成［7-9］参照本实验室已经建立的高效液相色谱分析方法［10］。流动相A为纯乙腈；B由0.45g KH2PO4、0.5m L TEA、100m L乙腈和900m L超纯水组成（pH 7.5）。色谱柱：Venusil C18柱（250mm×4.6mm ID，5μm）；梯度洗脱：0min，94%B；4m in，94%B；5m in，88%B；30m in，88%B。进样量10μL，流速1.0m L·m in-1，检测波长为250nm，柱温为35℃。

1.2.3.1 对照品溶液的制备 精密称取一定量的10种单糖，分别用10%甲醇溶液配制成0.1mol·L-1的母液。取适量母液稀释为5个不同浓度的系列单糖溶液，参考Honda等［9］衍生化方法并作适当的改进：取单糖混合溶液100μL，依次加入0.5mol·L-1PMP甲醇溶液200μL和0.3mol·L-1NaOH溶液300L。混匀后在70℃水浴反应60min，冷却至室温，用0.3mol·L-1HCl溶液300μL中和。加入氯仿1.0m L，振荡、离心，重复萃取3次。取上层水相加蒸馏水稀释至适当浓度0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液备用。

1.2.3.2 供试品溶液的制备 取杏鲍菇多糖20mg，加入2m L摩尔浓度为3mol·L-1的TFA，于安培瓶中混合，并用氮气封口于95℃酸解8h，之后1000r/min离心5m in，上清液转入5m L的圆底烧瓶中解压蒸干，再加入1m L超纯水溶解，得到酸解好的多糖样品。再取酸解好的样品100μL，按照1.2.3.1项下方法制备PMP标记物，得到样品的PMP标记物。

1.2.4 杏鲍菇多糖体外抗氧化活性研究

1.2.4.1 DPPH自由基清除能力测定 参照何念武［5］、TIAN［11］、吕喜茹［12］的方法稍作修改，参照盛伟［13］设置样品浓度范围，评价杏鲍菇多糖对DPPH自由基的清除能力。将3.0m L DPPH（1mmol）溶液与1.0m L不同浓度的样品溶液分别加入试管中，充分混合，黑暗处理30m in，517nm处测定吸光值。VC作阳性对照，用蒸馏水代替多糖溶液做阴性对照，用甲醇代替DPPH做本底组对照。清除率按以下公式计算：

清除率（%）=［1-（Aa-Ab）/A0］×100

其中，Aa为样品吸光值，Ab为样品本底吸光值，A0为阴性对照值。

1.2.4.2 羟基自由基的清除能力测定 参照何念武［5］、TIAN［11］、吕喜茹［12］的方法稍作修改，参照盛伟［13］的方法设置样品浓度，评价杏鲍菇多糖对羟基自由基的清除能力。向10m L离心管中依次加入1m L多糖溶液，1m L FeSO4溶液，1m L水杨酸-乙醇溶液和1m L H2O2溶液，于37℃水浴1h，然后在510nm处测定吸光值。用蒸馏水代替多糖溶液做阴性对照，用蒸馏水代替H2O2溶液做本底对照。清除率的计算：

清除率（%）=［1-（Aa-Ab）/A0］×100

其中，Aa为样品吸光值，Ab为样品本底吸光值，A0为阴性对照值。

1.2.4.3 超氧阴离子的清除能力测定 参照何念武［5］、TIAN［11］、吕喜茹［12］的方法稍作修改，参照盛伟［13］的方法设置样品浓度，测定杏鲍菇多糖对超氧阴离子的清除能力。向试管中依次加入1m L NBT溶液，1m L NADH溶液，1m L不同浓度的多糖溶液，0.4m L PMS溶液，充分混匀，静置5m in，在560nm处测其吸光值。用蒸馏水代替多糖溶液做阴性对照，蒸馏水代替PMS做本底组对照，VC做阳性对照。清除率计算：

清除率（%）=［1-（Aa-Ab）/A0］×100

其中，Aa为样品吸光值，Ab为样品本底吸光值，A0为阴性对照值。

1.2.4.4 总还原能力测定 参照Oyaizu［14］提供的方法对杏鲍菇多糖的总还原能力做评价。取1m L多糖溶液，加入2.5m L磷酸盐缓冲液（0.2mol/L，pH 6.6），2.5m L铁氰化钾溶液（1%），充分混合，50℃水浴20min，然后加入2.5m L的TCA（10%W/V）混匀，3000r/m in离心10m in，取上清液2.0m L，放入另一支试管中，依次加入2.0m L蒸馏水和0.5m L FeCl3（0.1%），混匀，室温静置10m in，然后于700nm处测定吸光值。VC做阳性对照，用蒸馏水代替0.1%FeCl3溶液做本底对照。

2 结果与分析

2.1 杏鲍菇多糖的总糖含量测定

以标准葡萄糖浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘得标准曲线，求得回归方程为y=10.18x+0.1084（R2=0.9928）。同时测得杏鲍菇粗多糖浓度0.08mg·m L-1时的吸光度为0.621，代入回归方程中计算出杏鲍菇粗多糖中所含单糖的浓度为0.05mg·m L-1，得到杏鲍菇多糖的总糖含量为62.9%。

2.2 HPLC分析杏鲍菇多糖的单糖组成

从标准品的高效液相色谱图1（B）中清晰的看出10种标准单糖的色谱峰。从样品的高效液相色谱图1（A）中能清晰的看出，杏鲍菇多糖样品中各组成单糖能够保持很好的基线分离其中1、2、3、4、6、7、8、10号位置的8种单糖含量较多。结果表明，杏鲍菇多糖是一种酸性杂多糖，单糖组成分别为D-甘露糖、D-核糖、D-鼠李糖、D-葡糖醛酸、D-葡萄糖、D-木糖、D-半乳糖、D-岩藻糖，所有定量的单糖相对摩尔百分比分别为9.8%、1.6%、0.15%、0.8%、62.8%、0.05%、24.4%、0.4%。

图1 样品（A）与标准品（B）高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatography of sample（A）and standards（B）

图2 杏鲍菇多糖与VC对DPPH的清除作用Fig.2 Concentration-dependent scavenging activity of Pleurotus eryngii polysaccharides against DPPH free radicals

表1 杏鲍菇多糖的组成测定结果Table 1 Analytical results of component monosaccharides of polysaccharides from Pleurotus eryngii

由标准品（5～25μL）的5个不同进样量经PMP标记和HPLC分析，获得各PMP标记单糖的峰面积。以标准品的峰面积（Y）为纵坐标，以各单糖物质的量（μmol）为横坐标，绘制标准曲线，得到10条回归曲线。将杏鲍菇多糖样品得到的10个峰面积带入相应的单糖回归曲线中即可计算出该单糖的物质的量和百分比。

2.3 杏鲍菇多糖体外抗氧化活性研究

2.3.1 对DPPH自由基的清除功效 DPPH在溶液中生成一个稳定的含氮自由基且该溶液呈典型的紫色，在紫外-可见（UV-Vis）光区具有较强的吸收光谱。当DPPH溶液中加入抗氧化剂时，由于其自由基清除作用使DPPH紫色消退导致吸收光谱强度随加入的抗氧化剂的量的增加而减小，通过加入抗氧化剂前后吸光度的变化计算自由基清除率［15］。由图2可知，VC对DPPH自由基的清除能力很强，当VC浓度为0.5mg·m L-1时，清除率即可达到91.04%。样品浓度在0.25～2.5mg·m L-1范围内，随着样品浓度的上升，杏鲍菇多糖对DPPH自由基的清除能力逐渐增强。当样品浓度为2.5mg·m L-1时，清除率为73%。对比何念武［5］的实验，清除率的变化具有相同的趋势，均随样品浓度升高而升高。结果显示，杏鲍菇多糖对DPPH自由基有一定的清除能力。

2.3.2 对羟基自由基的清除功效 Fenton反应［16］中FeSO4与H2O2反应产生·OH。·OH具有较高的反应活性，存活时间短。水杨酸能够有效捕捉·OH并产生有色物质，该物质在510nm处有强吸收峰。在反应体系中加入具有能清除·OH的物质，可以减少有色物质的生成。故可以通过在510nm处测定吸光值的变化来测定该物质清除羟自由基的能力，从而判断其抗氧化能力。由图3可知，VC对羟基自由基的清除能力很强，当VC浓度为0.5mg·m L-1时，清除率即可达到88.87%，清除能力几近饱和状态。杏鲍菇多糖对羟基自由基同样有一定的清除能力，样品浓度在0.25～2.0mg·m L-1范围内，随着浓度的上升，杏鲍菇多糖对羟基自由基的清除能力逐渐增强。当样品浓度为2.5mg·m L-1时，清除率为75%。对比何念武［5］的实验，清除率的变化具有相同的趋势，均随样品浓度升高而升高。对比盛伟［13］的实验，同等样品浓度下清除率略高于盛伟的结果。结果显示，杏鲍菇多糖对羟自由基有一定的清除能力。

图3 杏鲍菇多糖与VC对羟基自由基的清除作用Fig.3 Concentration-dependent scavenging activity of Pleurotus eryngii polysaccharides against hydroxyl free radicals

2.3.3 对超氧阴离子（O2·-）自由基的清除功效 在NADH-PMS-NBT体系中，NADH与NBT反应产生超氧阴离子，超氧阴离子与PMS结合生成的化合物显色并在560nm处具有最大吸光值。由图4可知，VC对超氧阴离子自由基的清除能力很强，当VC浓度为0.5mg·m L-1时，清除率即可达到88.65%，而杏鲍菇多糖对超氧阴离子自由基同样有一定的清除能力，样品浓度在0.25～2.0mg·m L-1范围内，随着浓度的上升，对超氧阴离子自由基的清除能力逐渐增强。当样品浓度为2.5mg·m L-1时，清除率为75%。对比何念武［5］的实验，清除率的变化具有相同的趋势，均随样品浓度升高而升高。对比盛伟［13］的实验，同等样品浓度下清除率略高于盛伟的结果。结果显示，杏鲍菇多糖对羟自由基有一定的清除能力。

图4 杏鲍菇多糖与VC对超氧阴离子自由基的清除作用Fig.4 Concentration-dependent scavenging activity of Pleurotus eryngii polysaccharides against superoxide anionfree radical

2.3.4 总还原能力的测定 抗氧化剂是通过自身的还原作用给出电子来清除自由基，还原力越大则抗氧化性越强。由此可根据还原力的大小来判断其抗氧化活性的大小。其反应生成物在700nm处的吸光度的大小即反映了抗氧化能力的大小，吸光度值越大则样品的还原能力越强［17］。由图5知，样品浓度在0.25～2.0mg·m L-1范围内，杏鲍菇多糖还原力测试混合液的吸光度随着质量浓度的增加而增大，当质量浓度为2.5mg·m L-1时，测试混合液的吸光度为0.633，对比何念武［5］的实验，清除率的变化具有相同的趋势，均随样品浓度升高而升高。对比盛伟［13］的实验，同等样品浓度下吸光度基本一致。结果显示，杏鲍菇多糖具有良好的还原能力。

图5 杏鲍菇多糖总还原能力Fig.5 Reducing power of Pleurotus eryngii polysaccharides

3 结论

采用水提醇沉法提取杏鲍菇粗多糖，测得其多糖的总糖含量达62.9%。利用柱前衍生化高效液相色谱法测得杏鲍菇多糖由D-甘露糖、D-核糖、D-鼠李糖、D-葡糖醛酸、D-葡萄糖、D-木糖、D-半乳糖、D-岩藻糖组成，其相对摩尔百分比分别为9.8%、1.6%、0.15%、0.8%、62.8%、0.05%、24.4%、0.4%。在体外抗氧化研究中表明杏鲍菇多糖具有良好的还原能力及对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子的清除能力。说明杏鲍菇多糖具有良好的抗氧化活性，能够作为一种天然的抗氧化剂。

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Study on analysis and antioxidant activity in vitro of the monosaccharide composition of Pleurotus eryngii

LUO Yi-yang，REN Dao-yuan，CHEN Li-fang，YANG Xing-bin*
（Key Laboratory for Medicinal Resource and Natural Pharmaceutical Chemistry，College of Food Engineering and Nutritional Science，Shaanxi Normal University，Xi'an 710119，China）

The polysaccharide was obtained with the water extraction and alcohol precipitation method. The totalcarbohydrate content and monosaccharide composition were measured by phenol-sulfuric acid method and1 - phenyl - 3 - methyl - 5 - pyrazolone pre -column derivatization high performance liquid chromatography（HPLC） method，resepectively. Moreover，the total reducing power and reducing power of Pleurotus eryngiipolysaccharides on DPPH and hydroxyl radicals and superoxide anion free radical in vitro was measured . Thetotal carbohydrate content of Pleurotus eryngii polysaccharide was 62.9％，which was composed of D-mannose，D-ribose，D-rhamnose，D-glucose，D-glucuronic acid，D-xylose，D-galactose and D-fucose with a relativemolar percentage of 9.8％，1.6％，0.15％，0.8％，62.8％，0.05％，24.4％，0.4％. The results showed that:Pleurotuseryngii polysaccharide was a typical heteropolysaccharide and had strong antioxidant activity.

Pleurotus eryngii；polysaccharide；monosaccharide composition；HPLC；antioxidant activity

TS201.1

A

1002-0306（2015）08-0158-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.023

2014－07－02

罗懿洋（1991-），女，硕士研究生，主要从事食品营养与功能方面的研究。

*通讯作者：杨兴斌（1969-），男，博士，教授，主要从事食品生物技术、食品分子营养与功能性食品方面的研究。

国家自然科学基金项目（C31171678）。