壳聚糖复合乙氧基喹啉处理对贮藏早红考密斯梨抗氧化性的影响

王宝刚，李文生，侯玉茹，杨军军，苗 飞

（1.北京市农林科学院林业果树研究所，北京100093；2.果蔬农产品保鲜与加工北京市重点实验室，北京100097）

壳聚糖复合乙氧基喹啉处理对贮藏早红考密斯梨抗氧化性的影响

王宝刚1，2，李文生1，侯玉茹1，杨军军1，苗 飞1

（1.北京市农林科学院林业果树研究所，北京100093；2.果蔬农产品保鲜与加工北京市重点实验室，北京100097）

探明壳聚糖复合乙氧基喹啉处理对梨贮藏期间抗氧化性和品质的影响。以‘早红考密斯'梨为试材，研究了壳聚糖复合乙氧基喹啉处理对梨贮藏期间自由基清除能力、抗氧化酶、抗氧化物质、品质和黑皮病发病率的影响。结果表明，壳聚糖复合乙氧基喹啉处理抑制了果实硬度和可滴定酸含量的下降，使黑皮病发生率降低了69.9%。该处理提高了果实的抗氧化能力，贮藏120d时，处理果的抗超氧阴离子自由基和抑制羟自由基能力分别比对照高8.4%和2.2%。壳聚糖复合乙氧基喹啉处理也诱导了果实中超氧化物歧化酶、抗坏血酸过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶和过氧化物酶活性，保持了较高的总酚、花青素、抗坏血酸、还原型谷胱甘肽含量。综上所述，壳聚糖复合乙氧基喹啉处理明显保持了‘早红考密斯'梨的抗氧化能力和采后品质，并显著抑制了果实病害。

‘早红考密斯'梨，壳聚糖，乙氧基喹啉，抗氧化性，品质

‘早红考密斯'梨（Pyrus communis L.cv.Early Red Com ice）是一种早熟、优质、国内外广泛栽培的西洋梨品种。其果面光滑，香气浓郁，风味酸甜，品质上等，具有很高的商品价值和营养价值［1］。但是，果实在采后贮藏及运输期间极易发生黑皮病，影响果实外观，降低商品价值，而且使果实抗性降低，造成巨大的经济损失［2-3］。前期的研究中利用壳聚糖对‘早红考密斯'梨进行涂膜处理，起到了抑制病害的作用，但是水溶性壳聚糖对维持果实中抗氧化物质和抗氧化性没有起到较好的效果［4］。乙氧基喹啉（又名6-乙氧基-2，2，4-三甲基-1，2-二氢化喹啉）是目前国内外广泛使用的高效抗氧化剂，由于其具有较强的防霉和保鲜的作用，常用于苹果、梨等水果的保鲜［5］。然而，壳聚糖复合乙氧基喹啉在西洋梨保鲜上的应用还未见报道。本研究采用水溶性壳聚糖复合乙氧基喹啉对‘早红考密斯'梨进行采后处理，分析梨果实在贮藏期间的自由基清除能力、抗氧化酶活性、抗氧化物含量以及贮藏品质，旨在为延长早红考密斯梨的贮藏期和维持其抗氧化性提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

‘早红考密斯'梨 采自北京市大兴区魏善庄镇；微孔膜保鲜袋 国家农产品保鲜工程技术研究中心；乙氧基喹啉（Ethoxyquin，EXQ） SIGMAALDRICH；水溶性壳聚糖（Water-soluble chitosan，WCTS，脱乙酰度＞85%，80目） 济南海得贝海洋生物工程有限公司；抗超氧阴离子自由基测试盒、抑制羟自由基测试盒 南京建成生物工程研究所第一分所。

TU-1810型紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；FT327型硬度计 意大利Facchini公司；PAL-1型折光仪 日本ATAGO公司；794型电位滴定仪 瑞士万通Metrohm公司；CR-400型色差计 日本M inolta公司；DK-S24型电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司；3K15型高速离心机 德国Sigma公司；KQ-250DB型超声提取器 昆山市超声仪器有限公司。

1.2 处理方法

果实采收后运回实验室，挑选大小和色泽相近、无机械伤、无病虫害的果实，经清水冲洗后，做如下3组处理：T1组1%WCTS，T2组1000μg/m L EXQ，T3组1%WCTS+1000μg/m L EXQ，对照为清水处理。WCTS和EXQ浓度由前期实验筛选得出。果实经处理液浸泡5min，晾干后，装入内衬微孔膜保鲜袋的纸箱中，经（0±0.5）℃敞口预冷24h后，然后封箱置于（0±0.5）℃冷库中贮藏。每隔20d取样，测定相关指标，并于60d开始统计黑皮病发病率。

1.3 指标测定方法

1.3.1 黑皮病发病率统计 在贮藏第60、80、100、120d时分别统计梨果实黑皮病发病率，以果实表面可见黑色病斑面积大于0.5cm2视为发病。

发病率（%）=（病害果个数/果实总个数）×100。

1.3.2 品质指标测定 硬度采用FT327型硬度计（探头直径8mm）测定；可溶性固形物（SSC）采用PAL-1型折光仪测定；可滴定酸（TA）采用电位滴定法测定［6］；色差指标a值（色度中红绿色差指标，正值代表红色程度，正值越大，红色越深；负值代表绿色程度，负值越小，绿色越深）采用CR-400型色差计测定。

1.3.3 铁还原能力测定 参考Wootton-beard等［7］的方法，测定样品将Fe3+还原成Fe2+的能力。称取5g样品，加入5m L 70%乙醇和少量石英砂冰浴研磨，10000r/m in离心10m in，取上清液并定容至10m L，即为500mg/m L提取液。铁还原能力以FRAP值表示，单位为mmol/kg。

1.3.4 DPPH自由基清除率测定 参考Wootton-Beard等［7］的方法。样品前处理同1.3.3。测定50mg/m L样品对DPPH自由基清除率。

1.3.5 抗超氧阴离子自由基测定 称取5g样品，加入5m L 0.1mol/L磷酸缓冲液（pH=7.5）和少量石英砂冰浴研磨，10000r/min离心10min，取上清液并定容至10m L，即为500mg/m L提取液。采用抗超氧阴离子自由基测试盒进行测定。

1.3.6 抑制羟自由基测定 样品前处理同1.3.5。采用抑制羟自由基测试盒进行测定。

1.3.7 抗氧化酶活性测定 过氧化物酶（POD）、谷胱甘肽还原酶（GR）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）和超氧化物歧化酶（SOD）活性参考曹建康等［8］的方法测定。

1.3.8 抗氧化物含量测定 总酚含量采用福林法［9］测定；果皮花青素含量采用示差法［10］测定；维生素C（VC）含量采用2，4-二硝基苯肼比色法［11］测定；还原型谷胱甘肽（GSH）含量参考曹建康等［8］的方法测定。

1.4 数据统计分析

各指标数据均为三组数据平均值，采用Excel 2007和SPSS 17.0统计学软件对实验数据进行分析。

2 结果与讨论

2.1 壳聚糖复合乙氧基喹啉处理对果实发病率的影响

从图1中可以看出，WCTS、EXQ和WCTS+EXQ处理均可以抑制果实病害的发生，而WCTS+EXQ处理的效果最好。对照果实从贮藏第60d开始出现病害，发病率为4.00%，此时，WCTS和EXQ单独处理果实也出现了病害，发病率均低于对照。WCTS+EXQ处理果实从贮藏第100d时才开始出现病害，发病率仅为2.04%，并且显著低于对照果（p＜0.05）。WCTS+EXQ处理果实在贮藏第100d和120d时的发病率分别比对照果低94.4%和69.9%。

图1 壳聚糖复合乙氧基喹啉处理对果实黑皮病发病率的影响Fig.1 Effects of chitosan combined with ethoxyquin treatment on superficial scald incidence of fruit

2.2 壳聚糖复合乙氧基喹啉处理对果实品质指标的影响

如表1所示，贮藏期间，果实硬度呈下降趋势。贮藏60d时，各处理果实硬度均高于对照，而120d时，仅WCTS+EXQ处理果实的硬度较高。在贮藏60d和120d时，WCTS+EXQ处理果实的硬度分别比对照高7.9%和9.5%，但各处理与对照之间差异不显著（p＞0.05）。在贮藏过程中，果实可溶性固形物呈现上升的趋势，且各处理与对照相比无显著性差异（p＞0.05）。可滴定酸是评价果实营养品质的重要指标之一。在贮藏过程中，果实中可滴定酸含量呈下降趋势，这是由于采后果实在进行正常的生理代谢，果实不断成熟衰老，消耗大量的有机物，有机酸作为直接的氧化底物被不断地分解［12］。其中，WCTS+EXQ处理果实的可滴定酸含量下降较缓慢。在贮藏60d和120d时，WCTS+ EXQ处理果实的可滴定酸含量分别比对照果高12.1%和4.3%（p＜0.05）。在贮藏过程中，‘早红考密斯'梨的色差指标a值呈现逐渐上升的趋势。其中，WCTS+ EXQ处理果实的色差指标a值上升较缓慢，在贮藏60d和120d时，处理果实的a值分别比对照果低21.6%和2.7%（p＜0.05）。综上所述，WCTS+EXQ处理对保持果实品质的效果较好。

表1 壳聚糖复合乙氧基喹啉处理对果实品质的影响Table 1 Effects of chitosan combined with ethoxyquin treatment on quality of fruit

2.3 壳聚糖复合乙氧基喹啉处理对果实铁还原能力和DPPH自由基清除能力的影响

从图2（A）中可以看出，随着贮藏时间的延长，梨果实的铁还原能力呈现先下降再上升的趋势，且对照及WCTS+EXQ处理果实的铁还原能力最低点分别出现在贮藏第60d和80d。在贮藏前60d，WCTS+EXQ处理果实的铁还原能力高于对照果，但60d之后低于对照果。由图2（B）所示，在贮藏过程中，梨果实DPPH自由基清除能力的变化趋势与铁还原能力的变化趋势相似，也呈现先下降再上升的趋势，且对照及WCTS+EXQ处理果实的DPPH自由基清除率最低点分别出现在贮藏第40d和80d。在贮藏前50d，WCTS+ EXQ处理果实的DPPH自由基清除能力高于对照果，但50d之后却低于对照果，这与梁皓等利用1-MCP负压渗透处理鲜枣的研究结果相似［13］。虽然，贮藏后期处理果的抗氧化能力低于对照，但并未出现衰老症状，可能是由于果实在低温逆境中生成了大量的活性氧所致，果实抗氧化能力的这种变化趋势也是由于抗氧化酶与抗氧化物质协同作用的结果。

图2 壳聚糖复合乙氧基喹啉处理对果实铁还原能力和DPPH自由基清除能力的影响Fig.2 Effects of chitosan combined with ethoxyquin treatment on FRAP and DPPH free radical scavenging capacity of fruit

2.4 壳聚糖复合乙氧基喹啉处理对果实抗超氧阴离子和羟自由基能力的影响

根据自由基衰老学说，衰老与自由基氧化引起机体细胞和组织慢性损伤有关。生物体内可通过多种途径产生自由基，同时，本身具有防止自由基形成和清除自由基的保护系统，使自由基维持在一个低而不至于引起伤害的水平［14-15］。如图3（A）所示，在贮藏过程中，经过WCTS+EXQ处理的果实具有较高的抗超氧阴离子自由基能力。在贮藏第120d时，WCTS+EXQ处理果实的抗超氧阴离子活力比对照高8.4%（p＜0.05）。研究显示，在抗氧化酶系统中，SOD对超氧阴离子自由基具有专一性的清除作用［16］，但从抗超氧阴离子活力（图3A）与超氧化物歧化酶活性（图4A）对比中可见，两者的变化趋势并不完全一致，可能是由于抗氧化酶和抗氧化物质共同起作用的结果。从图3（B）中可知，在贮藏过程中，WCTS+EXQ处理果实的抑制羟自由基能力明显高于对照。在贮藏120d时，WCTS+EXQ处理果实的抑制羟自由基能力比对照高2.2%（p＜0.05）。研究显示，酚类物质对羟自由基具有较好的清除作用［17］。从抑制羟自由基能力（图3B）与总酚含量（图5-A）对比中可见，两者的变化趋势相似。

图3 壳聚糖复合乙氧基喹啉处理对果实抗超氧阴离子和羟自由基能力的影响Fig.3 Effects of chitosan combined with ethoxyquin treatment on anti-superoxide anion and scavenging hydroxyl free radical capacity of fruit

2.5 壳聚糖复合乙氧基喹啉处理对果实中抗氧化酶活性的影响

果实的成熟和衰老与活性氧有着密切的关系，通常都伴随着活性氧的大量积累，而SOD、APX、GR、POD等是活性氧清除酶系统的重要保护酶，它们能有效地阻止高浓度氧的积累。SOD对超氧阴离子自由基具有歧化作用，它可以专一性催化消除O2-，生产H2O2，而H2O2的清除依赖于APX、GR、POD等抗氧化酶［16］。壳聚糖复合乙氧基喹啉处理诱导了果实贮藏前期SOD活性，不仅如此，该处理也诱导了其他几种抗氧化酶（APX、GR及POD）活性。从图4中可以看出，在贮藏过程中，WCTS+EXQ处理诱导了果实中SOD活性，在贮藏第120d时，处理果实中SOD活性比对照高29.6%（如图4A，p＜0.05）。WCTS+EXQ处理诱导了果实中APX活性，且在贮藏期间，该处理果实中APX活性比对照果实高78.3%～31.1%（如图4B，p＜0.05）。在贮藏前期，WCTS+EXQ处理果实的GR活性与对照果实无明显差异，而贮藏中期，WCTS+EXQ处理果实的GR活性迅速上升，在100d时达到最大值，是对照果实的2.3倍（p＜0.05），然后又迅速下降（如图4C）。对照果实中POD活性在贮藏第40d时达到高峰，之后呈下降趋势。WCTS+EXQ处理的果实中POD活性始终呈现上升的趋势，但贮藏前期，处理果的POD活性低于对照，可能是由于贮藏前期SOD与APX、GR的协同作用，降低了H2O2量，从而使POD活性维持了较低水平，防止了抗氧化成分在贮藏过程中的流失，提高了果实抗氧化能力［18-19］。处理果的POD活性在80d时超过对照，在贮藏120d时，WCTS+EXQ处理的果肉中POD活性是对照果的5.5倍（如图4D，p＜0.05），这与邹亚丽等［19］的研究结果相似，在果实贮藏后期，POD是主要作用酶，抑制果实衰老。

图4 壳聚糖复合乙氧基喹啉处理对果实抗氧化酶活性的影响Fig.4 Effects of chitosan combined with ethoxyquin treatment on antioxidant enzymes activity of fruit

2.6 壳聚糖复合乙氧基喹啉处理对果实中抗氧化物质含量的影响

植物体对自由基的清除还可以通过本身抗氧化物质完成。抗氧化物质包括酚类物质、维生素C、还原性谷胱甘肽（GSH）等。如图5（A）所示，在贮藏过程中，果实中总酚含量呈现缓慢上升趋势，WCTS+EXQ处理促进了果实中总酚含量的上升速度，于贮藏60d时达到最高值，此时果实中总酚含量比对照高40.5%。贮藏60d之后，处理果实的总酚含量略有下降，但仍然高于对照果。如图5（B）所示，贮藏前80d时，处理果实与对照果实的果皮花青素含量较为平稳，80d之后，迅速上升。在贮藏过程中，WCTS+EXQ处理果实的果皮花青素含量均高于对照果。如图5（C）所示，随着贮藏时间的延长，果实中VC含量呈现逐渐下降的趋势，但WCTS+EXQ处理果实中VC含量始终高于对照果，尤其是贮藏40～60d时较为明显，比对照高34.2%～48.9%。如图5（D）所示，在贮藏前80d内，WCTS+EXQ处理果实中GSH含量较高，尤其是贮藏第40d，比对照高58.8%，而贮藏后期低于对照，是由于贮藏后期处理果的GR活性迅速下降所致，这可能也是导致贮藏后期处理果抗氧化能力较低的原因之一。赵金伟等［17］的研究显示，苹果梨中酚类物质对DPPH自由基、·OH和亚硝酸根离子均有较好的清除效果。多酚可作为H供体夺取过氧化过程中产生的脂质过氧自由基；可与对氧化反应起催化作用的金属离子强烈络合，抑制氧化酶的作用；与VC等具有协同作用，可抑制维生素的自氧化［15］。研究显示，猕猴桃和柿中的酚类物质与抗氧化性具有显著的相关性，此外，酚类物质还可以延缓或阻止其他营养成分的氧化［20］。在本研究中，壳聚糖复合乙氧基喹啉处理保持了较高的总酚和果皮花青素含量，从而对提高抗氧化性起到了较好的作用。另外，该处理也提高了贮藏初期GSH含量以及保持了整个贮藏过程中VC的含量。因此，推测出壳聚糖复合乙氧基喹啉处理对提高果实抗氧化能力可能是通过酶途径和提高抗氧化物质含量的途径共同发挥作用的。

图5 壳聚糖复合乙氧基喹啉处理对果实抗氧化物质含量的影响Fig.5 Effects of chitosan combined with ethoxyquin treatment on antioxidant substances content of fruit

3 结论

壳聚糖复合乙氧基喹啉处理保持了‘早红考密斯'梨果实贮藏前期较高的铁还原能力和DPPH自由基清除能力以及贮藏过程中抗超氧阴离子自由基和抑制羟自由基能力，诱导了抗氧化酶（SOD、APX、GR、POD）活性。该处理也保持了较高的抗氧化物质（总酚、花青素、维生素C、还原型谷胱甘肽）含量。贮藏120d时，处理果的抗超氧阴离子自由基和抑制羟自由基能力分别比对照高8.4%和2.2%，SOD活性比对照高29.6%，POD活性是对照的5.5倍。贮藏60d时，处理果的总酚含量比对照高40.5%。研究推测，壳聚糖复合乙氧基喹啉处理对提高果实抗氧化能力可能是通过酶途径和提高抗氧化物质含量共同发挥作用的结果。同时，壳聚糖复合乙氧基喹啉处理维持了果实较好的品质指标，抑制了硬度和可滴定酸含量的下降，使黑皮病的发生率降低了69.9%，延缓了果实的衰老。

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Effect of chitosan combined with ethoxyquin treatment on antioxidantactivity in Pyrus communis L. cv. Early Red Comice during storage

WANG Bao-gang1，2，LIW en-sheng1，HOU Yu-ru1，YANG Jun-jun1，M IAO Fei1
（1.Institute of Forestry and Pomology，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing 100093，China；2.Beijing Key Laboratory of Fruits and Vegetable Storage and Processing，Beijing 100097，China）

The objective of the study was to clarify the effect of chitosan combined with ethoxyquin treatment onantioxidant activity and quality of pear. Free radical scavenging capacity，antioxidant enzymes，antioxidantsubstance，quality and superficial scald incidence of European pear（Pyrus communis L. cv. Early Red Comice）treated with chitosan combined with ethoxyquin were investigated. Results indicated that decline of firmnessand titratable acid content were inhibited by chitosan combined with ethoxyquin treatment. Compared with thecontrol，chitosan combined with ethoxyquin treatment could reduce the development of superficial scald by69.9％ . Chitosan combined with ethoxyquin treatment was beneficial to improving antioxidant activity. Antisuperoxideanion and scavenging hydroxyl free radical capacity treated with chitosan combined with ethoxyquinwere 8.4％ or 2.2％ higher than the control at 120d of storage，respectively. Chitosan combined with ethoxyquintreatment could induce activities of superoxide dismutase ， ascorbate peroxidase ， glutathione reductase ，peroxidase and keep higher content of total phenol，anthocyanin，vitamin C and reduced glutathione than thecontrol. In conclusion，chitosan combined with ethoxyquin treatment was beneficial to maintaining antioxidantactivity and quality of ‘Early Red Comice' pear，and inhibited the fruit disease.

‘Early Red Comice' pear；chitosan；ethoxyquin；antioxidant activity；quality

TS255.3

A

1002-0306（2015）08-0328-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.060

2014－04－25

王宝刚（1979-），男，博士，副研究员，主要从事果品物流及贮藏保鲜技术方面的研究。

北京市农林科学院青年基金经费资助（QN201121）；北京市农林科学院科技创新能力建设专项资助（KJCX20140205）。