响应面优化超声-微波协同提取黄秋花中总黄酮工艺的研究

盛 玮，滕井通，薛建平，段永波，耿秋瑾（.淮北师范大学生命科学学院，安徽淮北235000；2.资源植物生物学安徽省重点实验室，安徽淮北235000）

响应面优化超声-微波协同提取黄秋花中总黄酮工艺的研究

盛 玮1，2，滕井通1，2，薛建平1，2，段永波1，2，耿秋瑾1
（1.淮北师范大学生命科学学院，安徽淮北235000；2.资源植物生物学安徽省重点实验室，安徽淮北235000）

为确定黄秋葵花中总黄酮提取的最佳工艺，在单因素实验的基础上，应用响应面法优化黄秋葵花中总黄酮的提取条件。结果表明：微波功率、提取时间和料液比对黄酮提取率影响极显著；最佳工艺条件为：乙醇浓度70.3%（v/v）、微波功率263W、提取时间275s、料液比1∶30.2（g/mL），在此条件下，黄秋葵花中总黄酮的得率为3.937%。

超声-微波协同萃取，黄秋葵花，总黄酮，响应面法

黄秋葵［Abelmoschus esculentus（L.）Moench］为锦葵科秋葵属一年生草本植物，又名咖啡黄葵、秋葵、补肾草等，原产于非洲热带地区，现在我国南北方各地均有种植。可供食用的黄秋葵嫩果，富含蛋白质、多糖、不饱和脂肪酸、黄酮、维生素等多种生物活性物质［1］，具有抗疲劳、提高机体免疫力、抗癌、健胃保肝、减少肺损伤、利尿、增强血管扩张力、保护心脏等多种保健功能［2-3］，是一种有巨大发展潜力的营养保健蔬菜［4］。目前种植黄秋葵主要出售嫩果，其黄秋葵种子及花没有被利用，但富含蛋白质、多不饱和脂肪酸、多糖、黄酮［5-6］等活性物质。其黄酮类物质的含量较高［6］，而天然植物黄酮类化合物具有降脂、抗心血管疾病、消除自由其及抗氧化、抗骨质疏松、防癌抗癌等作用［7-9］，可广泛用于医药、化妆品［10］、食品等行业，具有极广阔的开发应用前景。

超声-微波协同萃取具有操作简单、有效缩短提取时间、提高提取率、降低能耗、节约生产成本等优点，已在色素、蛋白质、油脂、多糖、果胶等的提取中得到广泛应用［10-17］。本研究以黄秋葵花为原料，采用超声-微波协同萃取法提取黄秋葵花中总黄酮，通过响应面法优化黄秋葵花中总黄酮提取工艺，为开发利用黄秋葵花中的黄酮，提高黄秋葵种植效益提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黄秋葵花 采摘于淮北远创现代农业综合示范园，干燥、粉碎后过20目备用；95%乙醇、浓盐酸、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等 均为分析纯；芦丁标准品（＞98%） 中国药品生物制品检定所。

FDV超微粉碎机 北京环亚天元机械技术有限公司；CW-2000型超声-微波协同萃取仪 上海新拓微波溶样测试技术有限公司；AUX120型电子天平日本岛津公司；UV-4802型紫外可见分光光度计 尤尼科上海仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黄酮类化合物含量测定

1.2.1.1 芦丁标准溶液的配制及标准曲线的制定［18］准确称取芦丁标准品10.00mg，用75%的乙醇溶解并定容至50m L容量瓶中，其浓度为0.20mg/m L的芦丁标准溶液。准确吸取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5m L标准溶液于10m L的容量瓶中，再分别加入0.3m L浓度为5%NaNO2溶液，摇匀后放置6m in，加入0.3m L 10%A l（NO3）3溶液，摇匀后放置6m in，加入4.0m L浓度4%NaOH溶液，最后用75%的乙醇定容至刻度，摇匀，静置12m in，在400～700nm波长下扫描，结果显示在508nm波长处有最大吸收峰。故508nm处测定各浓度标准品的吸光度，以吸光度对质量浓度做标准曲线。芦丁标准品溶液在此质量浓度范围内与吸光度成良好线性关系，线性回归方程为A=11.201C－0.0131，R2=0.9998。

1.2.1.2 黄秋葵花中总黄酮含量的测定 取黄秋葵花提取液1.0m L置于10m L的容量瓶中，分别加入5% NaNO2溶液0.3m L，摇匀后放置6m in，加入10%A l（NO3）3溶液0.3m L，摇匀后放置6m in，再加入4%NaOH溶液4.0m L，最后用75%的乙醇定容至刻度，摇匀后静置12m in，在508nm处测定吸光度，根据线性回归方程换算成样品中的总黄酮含量。

1.2.2 黄秋葵花中总黄酮提取单因素研究

1.2.2.1 乙醇浓度的选择 称取5.0g黄秋葵花，按料液比1∶30（g/m L）加入不同体积浓度的乙醇溶液，微波功率240W，超声功率50W，萃取240s后，提取液过滤定容，按1.2.1方法测定黄秋葵花提取液吸光度，并计算黄秋葵花中总黄酮得率。

1.2.2.2 浸提时间的选择 称取5.0g黄秋葵花，按料液比1∶30（g/m L）加入70%的乙醇溶液，在微波功率240W及超声功率50W下，萃取不同的时间后，提取液过滤定容，按1.2.1方法测定黄秋葵花提取液吸光度，并计算黄秋葵花中总黄酮得率。

1.2.2.3 微波功率的选择 称取5.0g黄秋葵花，按料液比1∶30（g/m L）加入70%的乙醇溶液，超声功率50W，分别在不同的微波功率下，萃取240s后，提取液过滤定容，按1.2.1方法测定黄秋葵花提取液吸光度，并计算黄秋葵花中总黄酮得率。

1.2.2.4 料液比的选择 称取5.0g黄秋葵花，按不同的料液比分别加入70%的乙醇溶液，在微波功率240W及超声功率50W下，萃取240s后，提取液过滤定容，按1.2.1方法测定黄秋葵花提取液吸光度，并计算黄秋葵花中总黄酮得率。

1.2.3 黄秋葵花中总黄酮提取工艺的优化 在单因素实验的基础上，以超声波功率为50W，选取乙醇浓度（X1）、微波功率（X2）、提取时间（X3）和液料比（X4）四个因素为自变量，以黄秋葵花中总黄酮得率（Y）为评价指标，采用4因素3水平的Box-Behnken实验方法对提取条件进行优化，实验因素及水平设计见表1。

表1 Box-Benhnken响应面分析实验因素与水平Table 1 Factors and levels in the Box-Benhnken experimental design

式中，c为提取液黄酮的含量（mg/m L）；V为提取液的体积（m L），m为黄秋葵花干重（mg）。

1.2.5 数据统计分析 所有的实验均重复3次，利用Excel和M initab 15统计软件对实验结果进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同乙醇浓度的浸提剂对黄秋葵花中总黄酮提取效果的影响

由图1可知，乙醇浓度在40%～70%范围内，随着乙醇浓度增加，黄秋葵花中总黄酮得率增加，但乙醇浓度超过70%时，黄秋葵花中总黄酮得率反而下降，故提取剂乙醇浓度以70%左右为宜。

图1 乙醇浓度对黄秋葵花中总黄酮提取效果的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction

2.2 浸提时间对黄秋葵花中总黄酮提取效果的影响

由图2可知，在240s时间内，随时间的延长，黄秋葵花总黄酮提取率迅速增加。超过240s后，黄秋葵花总黄酮不再增加，反而出现下降，这可能是由于某些黄酮降解及提取剂挥发所致。从生产成本考虑，提取时间越长，能耗越大，故提取时间以240s左右为宜。

2.3 微波功率对黄秋葵花中总黄酮提取效果的影响

由图3可知，当微波功率在60～240W时，随着微波功率的增大，微波的作用逐渐加强，黄秋葵花总黄酮得率逐渐增加。当微波功率达到240W时，黄秋葵花中总黄酮得率达到最大，之后呈逐渐下降趋势，可能是由于较大微波功率使黄秋葵花中的某些黄酮类成分遭到破坏，从而导致黄酮得率有所下降，因此微波功率以240W左右为宜。

图2 浸提时间对黄秋葵花中总黄酮提取效果的影响Fig.2 Effect of extraction time on extraction

图3 微波功率对黄秋葵花中总黄酮提取效果的影响Fig.3 Effect of microwave output power on extraction

2.4 料液比对黄秋葵花中总黄酮提取效果的影响

由图4可知，料液比在1∶15～1∶30范围内，黄秋葵花中总黄酮得率随料液比的增加显著提高，其原因可能是随着料液比的增加黄酮的传质动力也增加，使得原料中更多的黄酮融入提取剂中。当料液比超过1∶30时，黄酮的提取率没有显著变化，因此，黄秋葵花中总黄酮提取料液比为1∶30左右为宜。

图4 料液比对黄秋葵花中总黄酮的浸提效果Fig.4 Effect of different ratio of material to solvent on extraction

2.5 超声-微波协同提取黄秋葵花中总黄酮的工艺优化

2.5.1 实验设计与结果 以单因素实验结果为基础，选取对黄秋葵花中总黄酮得率影响较大的乙醇浓度（X1）、微波功率（X2）、提取时间（X3）和液料比（X4）四个因素为自变量，以黄秋葵花中总黄酮得率（Y）为响应值，根据相应的实验表进行实验后，对数据进行二次回归拟合，得到包括一次项、二次项、交互项的二次方程，分析各因素的主效应和交互效应，最后在一定水平范围内求取最佳值，实验方案及结果见表2。

表2 响应面分析方案及实验结果Table 2 Experimental design and corresponding results for response surface analysis

2.5.2 模型方程的建立与显著性检验 利用M initab 15统计软件，对表2中实验数据进行多元回归拟合，获得黄秋葵花中总黄酮得率对编码自变量乙醇浓度、提取时间、微波功率和液料比的二次多项回归。根据实验结果建立的数学模型为：

表3的方差分析表明，回归方程具有高度的显著性（p≤0.01），R2=0.9929，表明响应值黄秋葵花中总黄酮得率实际值与预测值之间具有较好的拟合度。为检验方程的有效性，对黄秋葵花中总黄酮提取的数学模型进行显著性检验，结果见表4。由表4可知，一次项X2、X3和X4极显著（p≤0.01），说明提取时间、微波功率和液料比对黄秋葵花中总黄酮得率有极显著影响，乙醇浓度对黄秋葵花中总黄酮得率有显著影响（p≤0.05）。交互项X1X3、X1X4、X2X4极显著（p≤0.01），说明乙醇浓度和微波功率、乙醇浓度和料液比、提取时间和料液比交互项对黄秋葵花中总黄酮得率有极显著的影响。二次项X12、X22、X32和X42对黄秋葵花中总黄酮得率也有极显著的影响（p≤0.01）。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table

表4 回归方程偏回归系数的估计值Table 4 Estimated values of the partial regression coefficients of the regressionmodel

2.5.3 响应面分析 响应面图形是响应值Y对应于实验因素X1、X2、X3和X4所构成的三维空间的曲面图及其在二维平面上的等高线图，可以直观地反映各因素及他们之间的交互作用对响应值的影响。由图5（A）可知，提取时间对总黄酮得率的影响较显著，曲面较陡，在提取时间与乙醇浓度交互作用等高线中，等高线沿提取时间轴方向变化相对密集；由图5（B）可知，微波功率对总黄酮得率的影响较显著，曲面较陡，在微波功率与乙醇浓度交互作用等高线中，等高线沿微波功率轴方向变化相对密集略高于乙醇浓度轴方向；

图5 各因素交互作用对黄秋葵花中总黄酮得率影响的响应面图Fig.5 Response surface plots showing the interaction effects of four reaction conditions on the yield of total flavonoids

由图5（C）可知，料液比对总黄酮得率的影响较显著，曲面较陡，在料液比与乙醇浓度交互作用等高线中，等高线沿料液比轴方向变化相对密集；由图5（D）可知，提取时间对总黄酮得率的影响较显著，曲面较陡，在提取时间与微波功率交互作用等高线中，等高线沿提取时间轴方向变化相对密集。图5（A、B、C、D）等高线呈椭圆形，说明乙醇浓度与提取时间、乙醇浓度与微波功率、乙醇浓度与料液比及微波功率与提取时间的交互作用较强，对黄秋葵花中总黄酮得率影响显著。

2.5.4 黄秋葵花中总黄酮最佳提取条件的确定和实验验证 在选取的各因素范围内，根据回归模型通过Minitab 15软件分析得出，黄秋葵花中总黄酮最佳提取工艺参数为：乙醇浓度70.288%、超声-微波协同萃取时间274.824s、微波功率263.274W、料液比1∶30.202（g/m L），黄秋葵花中总黄酮提取得率预测值为3.95%。考虑到实际操作的便利，确定黄秋葵花中总黄酮的超声-微波协同波提取工艺条件为：超声-微波协同提取时间275s、微波功率263W、乙醇浓度70.3%、料液比1∶30.2（g/m L）。为了证实预测的结果，以最佳工艺参数做3次平行实验，黄秋葵花中总黄酮得率平均为3.937%±0.052%，与预测值为3.95%基本一致（相对误差0.481%），说明该方程与实际情况拟合很好，充分验证了所建模型的正确性，说明响应曲面法适用于对黄秋葵花中总黄酮的超声-微波协同提取工艺进行回归分析和参数优化。

3 结论

在单因素实验基础上，利用实验设计软件Minitab 15，采用响应面法建立了黄秋葵花中总黄酮提取工艺条件的二次多项式数学模型，对各因子对响应值的影响进行了分析。结果表明模型拟合程度高，实验误差较小。优化得到的黄秋葵花中总黄酮提取工艺条件为超声-微波协同萃取时间为275s、微波功率为263W、乙醇浓度为70.3%、料液比为1∶30.2（g/m L）。在此工艺条件下，黄秋葵花中总黄酮得率率为3.937%。

［1］黄阿根，陈学好，高云中，等.黄秋葵的成分测定与分析［J］.食品科学，2007，28（5）：451-455.

［2］李建华，陈珊.黄秋葵水提取液抗疲劳的药效学观察［J］.中国运动医学杂志，2004，23（2）：196-197.

［3］赵焕焕，贾陆，裴迎新.黄秋葵粗多糖体外抗氧化活性测定［J］.郑州大学学报：医学版，2012，47（1）：40-43.

［4］单承莺，马世宏，张卫明.保健蔬菜黄秋葵的应用价值与前景［J］.中国野生植物资源，2012，31（5）：68-71.

［5］詹忠根，李煜键，张宇.黄秋葵种子主要营养成分测定［J］.营养学报，2012，34（2）：191-192.

［6］胡帅，张骋，李强，等.不同黄秋葵花中总黄酮的提取和含量测定［J］.激光生物学报，2013，22（4）：375-378.

［7］延玺，刘会青，邹永青，等.黄酮类化合物生理活性及合成研究进展［J］.有机化学，2008，28（9）：1534-1544.

［8］任虹，张乃元，田文静，等.源于果蔬的黄酮类化合物及其抗肿瘤作用靶点研究进展［J］.食品科学，2013，34（11）：321-326.

［9］鲁晓翔.黄酮类化合物抗氧化作用机制研究进展［J］.食品研究与开发，2012，33（3）：220-224.

［10］焦晶晶，张英.植物类黄酮作为护肤因子在化妆品领域的研究进展［J］.精细化工，2004（S21）：98-102.

［11］汪河滨，郭志愿，赵小亮.超声-微波协同萃取灰叶胡杨花粉中总黄酮的工艺研究［J］.食品科学，2009，30（2）：61-64.

［12］辛晓晨，裴志胜，袁腊梅，等.响应面法优化超声-微波协同萃取槟榔籽油及其脂肪酸组成分析［J］.食品科学，2012，33（2）：67-71.

［13］陈义勇，窦祥龙，黄友如，等.响应面法优化超声-微波协同辅助提取茶多糖工艺［J］.食品科学，2012，33（4）：100-103.

［14］盛玮，高翔，薛建平，等.超声-微波协同提取超级黑糯玉米芯色素的工艺研究［J］.中国粮油学报，2011，26（9）：38-43.

［15］宁海凤，童群义.超声-微波协同萃取豆腐柴叶中果胶的研究［J］.食品科技，2011，36（3）：148-151.

［16］刘振春，耿存花，孙慧娟，等.响应面优化超声波-微波协同提取高粱醇溶蛋白工艺［J］.食品科学，2014，35（4）：21-25.

［17］陈卫云，张名位，廖森泰.荔枝多糖超声微波酶解协同提取工艺优化［J］.中国食品学报，2013，13（5）：77-84.

［18］张吉祥，欧来良.正交实验法优化超声提取枣核总黄酮［J］.食品科学，2012，33（4）：18-21.

Optimization of ultrasonic-microwave synergistic extraction of total flavonoids from Abelmoschus Esculentus（L.）Moench by response surface methodology

SHENG Wei1，2，TENG Jing-tong1，2，XUE Jian-ping1，2，DUAN Yong-bo1，2，GENG Qiu-jin1
（1.College of Life Sciences，HuaibeiNormal University，Huaibei235000，China；2.Anhui Key Laboratory of Plant Resources and Biology，Huaibei235000，China）

To optimize the extraction technology of total flavonoids from flowers of Abelmoschus esculentus（L.）Moench，response surface methodology was applied on the basis of single factor tests. The results showed thatmicrowave power，extraction time and liquid-to-material ratio had extremely significant effect on the extractionyield of flavonoids. Results showed that the optimum conditions were as follows:ethanol concentration 70.3％（v/v），microwave power 263W，extraction time 275s and solid/liquid ratio 1∶30.2（g/mL）. Under the optimized conditions，the exaction yield of total flavonoids from flowers of Abelmoschus esculentus（L.） Moench was 3.937％.

ultrasonic-microwave synergistic extraction；flowers of Abelmoschus esculentus（L.）Moench；total flavonoids；response surface methodology

TS201.1

B

1002-0306（2015）08-0290-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.052

2014－06－03

盛玮（1963-），男，硕士，教授，研究方向：食品生物技术。

安徽省教育厅自然基金项目（KJ2012A255）；资源植物生物学安徽省重点实验室开放基金项目（ZYZWSW2014003）。