超声提取日本楤木叶片芦丁工艺优化

茹丽叶，李德生，翁喜娇，王 璠，彭 玲

（天津理工大学环境科学与安全工程学院，天津300384）

超声提取日本楤木叶片芦丁工艺优化

茹丽叶，李德生*，翁喜娇，王 璠，彭 玲

（天津理工大学环境科学与安全工程学院，天津300384）

利用响应面曲线法优化超声提取日本楤木叶片中芦丁的工艺条件。在单因素实验的基础上，采用中心组合设计响应面实验，研究了乙醇浓度、提取时间及液料比对日本楤木叶中芦丁提取量的影响，并建立了二次回归方程，确定提取芦丁的最佳工艺组合条件：乙醇浓度为76%，超声时间为54min，液料比为57∶1mL/g；该条件下日本楤木叶片中芦丁提取含量理论值为2.222mg/g，实测值为2.187mg/g。

日本楤木，芦丁，响应面，提取工艺

日本楤木为五加科楤木属落叶小乔木，是兼食用、药用、保健为一体的天然木本蔬菜。日本楤木根、茎、叶中富含多种维生素、皂苷、黄酮、氨基酸、矿物元素等［1］；其嫩芽可食用，风味独特，口感极佳；其根皮、茎皮皆可入药，可用于治疗心血管疾病、肝炎、糖尿病，具有抑制肿瘤生长，降低血糖血脂，抗疲劳，抗缺氧，增强免疫力的功效［2-5］。

超声波提取法主要利用超声波的空化作用破坏植物细胞，使提取剂易于渗入细胞，从而提高提取效率［6］。超声提取法因其省时、耗能低、操作简便已被广泛应用于生物活性物质的提取中。目前对楤木属植物的研究多为分析其化学成分及药理活性［7-10］，在其黄酮类化合物的研究中，仅有采用硝酸铝显色法和紫外分光光度计法测定总黄酮及回流提取总黄酮的工艺条件优化［11-13］，对日本楤木的超声提取、高效液相法测定芦丁的工艺条件优化还未见报道。

本文以日本楤木叶片为原料采用超声提取的方法，在单因素实验的基础上采用响应面法研究乙醇浓度、提取时间和液料比对芦丁提取量的影响［14-15］，优化日本楤木叶片中芦丁的工艺条件，提高提取效率。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甲醇（色谱纯）、无水乙醇、石油醚（60～90） 北京普博欣试剂公司；超纯水 天津市清源泉纯净水经营部；芦丁标准品（纯度≥98%） 贵州迪大生物科技有限责任公司；日本楤木叶片 天津理工大学玻璃温室，采收时间为8月份和11月份。

高效液相色谱仪（Com 6000型，紫外检测器） 美国CoMetro公司；超声波清洗器 天津奥特赛恩斯仪器有限公司；RE-52型旋转蒸发仪 巩义市予华仪器有限责任公司；SH2-D型循环水式真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司；电子分析天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；HHS-2S型恒温式水浴锅 上海宜昌仪器纱筛厂。

1.2 实验方法

1.2.1 芦丁超声提取流程 将烘干的日本楤木叶片研磨成粉末，过60目筛，精密称取2g，置于150m L三角瓶中，加适量体积分数的乙醇溶液，25℃下超声提取一段时间，减压抽滤，滤液减压蒸发除去乙醇，超纯水溶解并定容至100m L，溶液用100、50、50m L石油醚分别萃取3次，取水层，沸水浴蒸干，最后用甲醇溶解并定容至25m L，过0.22μm有机膜待测［16-17］。

1.2.2 芦丁标准曲线的制作 准确称取烘干的芦丁标准品20mg，用甲醇溶解并定容至25m L，摇匀，制得标准品储备液，浓度为0.8mg/m L。精密量取芦丁标准品储备液0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0m L，用甲醇定容至10m L，摇匀，得系列质量浓度对照品溶液，分别取上述溶液20μL注入高效液相色谱仪，在360nm波长处测定其峰面积。

1.2.3 芦丁的检测 采用高效液相色谱法对日本楤木叶片中的芦丁进行测定，色谱柱：CoMetro Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm），柱温30℃，流速：1m L/m in，检测波长：360nm，进样量：20μL，流动相：甲醇∶水= 43∶57（磷酸调节pH=3）。

1.2.4 单因素实验设计

1.2.4.1 乙醇浓度对超声提取芦丁的影响 在液料比40∶1m L/g，超声30min的条件下，以体积分数分别为60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液为提取剂对芦丁进行提取，比较日本楤木叶片中芦丁的提取量。

1.2.4.2 提取时间对超声提取芦丁的影响 在液料比40∶1m L/g，乙醇体积分数80%的条件下，分别超声提取20、30、40、50、60m in，比较日本楤木叶片中芦丁的提取量。

1.2.4.3 液料比对超声提取芦丁的影响 在乙醇体积分数80%，超声30min的条件下，选取液料比为20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1m L/g分别对芦丁进行提取，比较日本楤木叶片中芦丁的提取量。

1.2.5 响应面实验设计 在单因素实验基础上，通过BOX-Behnken中心组合设计原理，以乙醇浓度、提取时间、液料比为实验因素，以芦丁含量为响应值，运用Design-Expert.V8.0.6软件设计三因素三水平的响应面实验，对超声提取日本楤木叶片中芦丁的最佳工艺条件进行优化。响应面实验设计见表1。

表1 芦丁超声提取响应面实验设计Table 1 Response surface experiment design of ultrasound assisted extraction of rutin

1.3 数据处理

所有的实验数据均为三个平行的均值，单因素实验所得数据用Oringe分析和处理；响应面实验数据用Design-Expert软件分析、处理。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线的建立

以峰面积为横坐标（X），进样质量浓度（mg/m L）为纵坐标（Y）进行线性回归，得芦丁回归方程：Y= 0.77234+6.21898E-5X，R2=0.9999。结果表明，芦丁在0.008～0.640mg/m L范围内线性关系良好。

2.2 芦丁超声提取的单因素实验

2.2.1 乙醇溶度对超声提取芦丁的影响 乙醇浓度对芦丁提取量的影响结果见图1。从图1中可以看出，在一定范围内，随着乙醇浓度的增加芦丁提取量随之上升，到80%时达到最高，但当乙醇浓度超过80%后，芦丁提取量出现降低的趋势，故选择乙醇浓度80%为宜。

图1 乙醇浓度对芦丁提取效果的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on rutin extraction

2.2.2 提取时间对超声提取芦丁的影响 不同提取时间对芦丁提取量的影响结果如图2所示。从图2可知，芦丁提取量随着提取时间的延长而增大，超过50min后，芦丁含量略有下降，可能由于原料中其他醇溶性物质的被溶解提出［18］，或者长时间超声破坏某些黄酮类化合物的结构［19］，使芦丁提取率下降，故选择50m in为宜。

图2 提取时间对芦丁提取效果的影响Fig.2 Effect of ultrasonic time on rutin extraction

2.2.3 液料比对超声提取芦丁的影响 不同液料比对芦丁提取量的影响结果如图3所示。从图3中可以看出，芦丁的提取量随着液料比的增加呈上升趋势，超过50∶1后，芦丁的提取量反而下降，可能是因为增加溶剂量有利于芦丁从原料向浸出提液扩散，提高芦丁浸出率，当用量增加到一定程度时，会使杂质的溶出量增加，从而降低提取液中芦丁的浓度［20］，故液料比以50∶1m L/g为宜。

图3 不同液料比对芦丁提取量的影响Fig.3 Effect of solid-liquid radio on rutin extraction

2.3 响应面优化实验

在单因素实验基础上，根据Box-Bchnken实验设计原理，选择乙醇浓度、提取时间、液料比进行三因素三水平的响应面分析，响应面分析方案及结果见表2。所得数据经过多元回归拟合，得到二次回归方程：Y=2.18-0.10A+0.036B+0.055C-0.028AB-0.033AC-0.016BC-0.16A2-0.045B2-0.046C2。

表2 芦丁提取响应面分析方案及结果Table 2 Design and experiment result of response surface methodology of rutin extraction

对该回归模型进行方差分析，结果见表3。从表3可看出，响应回归模型p＜0.0001，达到了极显著水平；因变量和全部自变量之间的p值均小于0.05，说明乙醇浓度、提取时间和液料比之间的交互作用明显，线性关系显著；失拟项p=0.1177＞0.05，不显著，模型的校正系数R2=0.9978，说明模型对实验拟合程度较好，模型修正相关系数R2Adj=0.9949，说明该模型很好地反应了乙醇浓度、提取时间、液料与芦丁提取含量的关系，因此可以用此模型对日本楤木叶片中芦丁成分进行预测、分析，确定超声提取芦丁的最佳工艺条件。

表3 回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the regressionmodel

由回归方程所做的响应曲面和等高线如图4～图6所示。响应曲面图反映的是一个因素取零水平时，另外两个因素的交互作用对芦丁提取量的影响情况［21］。该因素对芦丁提取量的影响越显著，表现为响应曲面越陡峭，反之，响应曲面越平缓［22］。等高线的形状反映的是各因素之间的交互作用的强弱，圆形表明交互作用弱，影响不显著，椭圆形则相反［23-24］。

由图4～图6可以看出，随着各因素的增加或减小，芦丁提取量都呈现出先增大后减小的趋势，说明各因素在所选范围内可以产生最大响应值；乙醇浓度变化的响应曲面较超声提取时间和液料比的响应曲面陡，说明乙醇浓度对芦丁提取量的影响最显著，液料比次之。乙醇浓度与超声提取时间和液料比的等高线都呈椭圆形，说明两两交互作用强，而提取时间与液料比的等高线趋于圆形，交互作用相对较弱，与回归方程分析结果一致。

图4 提取时间和乙醇浓度的响应面Fig.4 Response surface graph of extracting time and ethanol concentration

通过Design Expert软件分析出芦丁提取的最佳工艺条件：乙醇浓度为75.91%，提取时间54.10m in，液料比56.68∶1，提取芦丁含量的预测值为2.222mg/g。考虑实际操作难以达到，将最优条件修正为：乙醇浓度76%，提取时间54m in，液料比57∶1m L/g。同时进行三次验证实验，得芦丁平均含量为2.187mg/g，与理论预测值接近，证实了此模型的可靠性。

图5 液料比和乙醇浓度的响应面Fig.5 Response surface graph of solid-liquid radio and ethanol concentration

图6 液料比和提取时间的响应面Fig.6 Response surface graph of solid-liquid radio and extracting time

3 结论

通过单因素及响应面实验得到乙醇-超声提取日本楤木叶片中芦丁的最佳工艺条件，并结合实际操作确定其最佳工艺条件为：乙醇浓度76%，提取时间54m in，液料比57∶1m L/g，该条件下芦丁提取含量理论值为2.222mg/g，实测值为2.187mg/g。超声提取日本楤木叶片中的芦丁，省时、便捷，提取效率较高，可为黄酮类化合物的有效利用提供理论依据。

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Optimizing ultrasonic-assisted extraction of rutin extraction from leaves of Aralia elata var.inerm is

RU Li-ye，LIDe-sheng*，WENG Xi-jiao，WANG Fan，PENG Ling
（School of Environment Science and Safety Engineering，Tianjin University of Technology，Tianjin 300384，China）

The response surface methodology was used to optimize ultrasonic-assisted extraction technology ofrutin from Aralia elata var.inermis. Based on single factor tests，a central composite design experiment wasconducted and the response surface analysis was employed to investigate the influence of three factorsincluding concentration of ethanol，the extraction of time，and solid liquid ratio on the yield of rutin and then aquadratic regression model was established. The best concentration of ethanol，the extraction of time，and solidliquid ratio were 76％，54min，57∶1mL/g，under which the predicted yield of rutin extraction from leaves of Araliaelata var.inermis with the optimized procedure was 2.222mg/g，and the practical yield of rutin was 2.187mg/g.

Aralia elata var.inerm is；rutin；response surface methodology；extraction conditions

TS201.1

B

1002-0306（2015）08-0282-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.050

2014－08－04

茹丽叶（1989-），女，硕士研究生，研究方向：林学、生态学。

*通讯作者：李德生（1964-），男，博士，教授，研究方向：环境科学与生态学的教学和研究。

天津市科技支撑计划重点项目（12ZCZDNC00400）；天津市教学改革重点项目（C03-0825）；天津市农业科技成果转化与推广项目（0801160）；国家大学生创新创业训练计划项目（201310060007）。