荷叶多酚提取优化及其在黄酒中的应用

许惠玲，蔡为荣，*，曹天亮，王伟霜

（1．安徽工程大学生物与化学工程学院，安徽芜湖241000；2．安徽金沃农业有限公司，安徽南陵242400）

荷叶多酚提取优化及其在黄酒中的应用

许惠玲1，蔡为荣1，*，曹天亮2，*，王伟霜1

（1．安徽工程大学生物与化学工程学院，安徽芜湖241000；2．安徽金沃农业有限公司，安徽南陵242400）

优化了荷叶多酚提取工艺提高荷叶资源利用及其在黄酒中的应用分析。在单因素实验的基础上，正交实验法对提取时间、液料比、乙醇浓度及提取温度等提取条件进行了优化。结果表明，优化工艺为：乙醇浓度50%，提取时间50min，液料比60∶1mL/g、提取温度50℃，荷叶多酚得率为9.01mg/g。利用荷叶多酚浓缩液配制荷叶黄酒，测得的理化指标与口感评分通过SPSS软件进行主成分和逐步回归分析，建立的回归方程经方差分析达到极显著水平，故对荷叶黄酒的品质预测是可行的。最终得出荷叶黄酒最佳配方为基酒与多酚比例为25∶5。

荷叶，多酚类化合物，提取，荷叶黄酒，主成分分析

医学研究表明，植物多酚具有抗氧化、抑制高血压［1］、抗肿瘤［2］、防龋齿、抑口臭［3］等作用。Ruf报道多酚物质能抑制血小板的聚集和粘连，从而可以预防中风、动脉粥样化作用［4］。荷兰、日本等7国免疫学调查表明，多酚的平均摄入量低于19mg/d比摄入23mg/d，患心脏病的几率高1/3［5］。源于自然、无毒、具有多种生物活性的植物多酚及制品越来越受到医学、食品、日用化工等行业的青睐。

荷叶（Lotus leaf）系睡莲科莲属（Nelumbo nucifea Gaertn）植物的叶片，1991年已被列入卫生部“既是食品又是药品”的名单之中。中国莲起源于我国，分布于祖国大江南北，盛产于长江、黄河、珠江等三大流域，栽培或野生于池塘、水田中。资源丰富的荷叶大多自然腐烂掉，没有得到有效地利用。文献表明［4，6］，荷叶中含有邻羟基苯甲酸、槲皮素、没食子酸等，而对荷叶中植物多酚的提取报道极少。且目前对于黄酒品质的研究主要集中在其风味挥发性或半挥发性成分［7］及用现代检测技术测定其理化指标，很少有用主成分回归分析来建立模型实现对黄酒品质的评价。故本研究采用正交实验法优化荷叶多酚的提取工艺，以期为荷叶资源的充分利用、减少能源和降低溶剂消耗等提供有益参考。并将提取出的荷叶多酚与基酒按比例混合调制成荷叶黄酒，对其口感进行评价，对测定出的荷叶黄酒中的主要理化指标与口感评分进行主成分回归分析，以实现在一定程度上可以基于口感评分的结果对荷叶黄酒的理化指标进行预测，从而为荷叶黄酒的配方和口感评估提供参考，以期用于以后的工厂化生产。主成分分析［8］就是利用数学上降维处理问题的思维方法，将所研究对象的若干指标变量重新组合成一组新的、线性无关的几个综合指标来代替原来的指标变量；从而实现对所研究对象的简化与综合评价。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

荷叶 采集于安徽省芜湖市安徽工程大学水塘；黄酒基酒（大饭） 安徽金沃农业有限公司；Folin-Ciocalteu试剂、没食子酸 Sigma公司；无水乙醇、无水碳酸钠等试剂 均为分析纯。

DZF-1型真空干燥箱 上海跃进医疗器械厂；LXJ-Ⅱ型离心机 上海医用分析仪厂；SHB-ⅢA型循环水式多用真空泵 郑州市上街华科仪器厂；RE-52型旋转蒸发器 上海青浦沪西仪器厂；HH-2型数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；721型分光光度计 上海精密科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 荷叶多酚提取工艺流程

1.2.2 总酚含量的测定与得率计算 采用Folin-Ciocalteu比色法［9］。

在760nm波长下测定没食子酸浓度（线性范围：0.0005～0.005mg/m L）与吸光度的标准曲线回归方程为：

据此计算荷叶总酚（Total polyphenolics：TP）得率（以没食子酸计）：

式中：C—没食子酸浓度（mg/m L）；V—提取液的总体积（m L）；m—荷叶粉质量（g）；β—提取液总酚稀释因子。

1.2.3 荷叶多酚提取实验设计及优化

1.2.3.1 单因素实验 称取2g的荷叶干粉，以荷叶多酚得率为指标，考察提取温度、提取时间、液料比对多酚得率的影响。

a.乙醇浓度对荷叶多酚得率的影响：固定液料比为50m L/g，提取时间1h，提取温度50℃，提取二次，乙醇浓度分别为20%、30%、40%、50%、60%、70%，然后按照多酚提取工艺进行实验。b.液料比对荷叶多酚得率的影响：固定提取时间1h，提取温度50℃，提取二次，乙醇浓度为50%，液料比分别为30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1m L/g，然后按照多酚提取工艺进行实验。c.提取温度对荷叶多酚得率的影响：固定提取时间1h，提取二次，乙醇浓度为50%，液料比为50m L/g，提取温度分别为20、30、40、50、60、70℃，然后按照多酚提取工艺进行实验。d.提取时间对多酚得率的影响：固定液料比为50m L/g，提取二次，乙醇浓度为50%，提取温度为40℃，提取时间分别为2、4、6、8、10、12h，然后按照多酚提取工艺进行提取。

1.2.3.2 正交实验设计 在单因素实验的基础上，选择单因素实验中对响应值（多酚得率）有较明显影响的数据区间，选取乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间4个因素，采用L9（34）正交实验设计（因素水平设计见表1），以多酚得率作为指标优化提取条件。

表1 L9（34）正交实验设计的因素与水平Table 1 Factors and levels of L9（34）orthogonal test

1.2.4 荷叶多酚黄酒的调配与理化指标的测定 用淋饭酒不同后发酵期的基酒与提取的荷叶多酚浓缩液（其浓度为4.707mg/m L）按照50∶2、25∶2、50∶3、25∶3、50∶4、25∶4、50∶5、25∶5、50∶6、25∶6 10种比例混合得到酒样经发酵15d，测定这10种混合酒液的总酸、氨基酸态氮、多酚、总糖、酒精度的含量。

1.2.5 荷叶黄酒的评分 根据黄酒GB/T 13662-2008、QB/T 2746-2005清爽型黄酒评分标准，由8位具有一定资历的高级品酒师对酿造的荷叶黄酒进行口感品质评分，求得其平均值后即为最终的口感评分。其口感评分表［10］如表2所示。

表2 品酒的评分标准Table 2 The grading standard of tasting wine

1.3 数据处理方法

对测得的荷叶黄酒的固形物含量（总酸、氨基酸态氮、多酚、总糖、酒精度的含量）和口感评分采用SPSS version 21统计软件，用主成分分析和逐步回归分析作为统计方法，用双尾检测，当显著水平为0.05表示为显著，为0.01时为极显著。回归方程的相关系数r2≥0.8，视为高度相关；0.5≤r2＜0.8，视为中度相关；0.3＜r2＜0.5，视为弱相关［11］。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验及分析

2.1.1 乙醇浓度对荷叶多酚得率的影响 多酚化合物的提取通常有溶剂法、络合沉淀、层析法［12］。本实验采用溶剂法提取荷叶多酚。从图1中可以看出，乙醇浓度对荷叶多酚得率影响的大致规律，随着乙醇浓度的升高，多酚的提取率先呈上升的趋势，当乙醇浓度达到50%时荷叶多酚提取率达到最大值，之后随着浓度的增加，提取率反而降低。这是因为荷叶多酚中大部分都属于类黄酮化合物及其衍生物，其溶解度随着结构的改变而改变。其中有一部分是水溶性的，如果水分含量少会导致荷叶多酚不能充分溶解［13］。因此初步确定50%乙醇浓度为提取多酚的最佳提取剂浓度。

图1 提取溶剂对多酚得率的影响Fig.1 Effects of differentextraction solvents on TP yield

2.1.2 液料比对荷叶多酚得率的影响 从图2中可以看出，当液料比达50∶1（m L/g）时，多酚提取得率达到8.55mg/g，继续增加提取溶剂用量，多酚提取得率没有显著提高。这是因为液料比较小时，荷叶粉溶解不充分；随着液料比例的增加，荷叶粉在溶剂内扩散越快，多酚得率提高［14］；当提取溶剂的量过大时，多酚得率增加缓慢最终趋于稳定，原因可能是提取溶剂达到一定量时多酚几乎溶解完全［15］。因此初步确定最佳液料比为50∶1m L/g。

图2 液料比对多酚得率的影响Fig.2 Ratio of liquid to solid on TP yield

2.1.3 提取温度对荷叶多酚得率的影响 从图3中可以看出，在20～40℃多酚得率的升高幅度较为明显，这是由于随着温度的升高，分子运动加速，氢键更易断裂，多酚的渗透、溶解、扩散速度也加快，因而酚类物质更易于从原料中溶出，而在温度为40～70℃时，多酚得率随着温度的升高而下降，这是因为高温下多酚类物质易于发生氧化或降解反应从而可能会破坏多酚的结构，综合考虑温度对多酚稳定性及得率的影响，因此初步确定40℃为最佳提取温度。

图3 提取温度对多酚得率的影响Fig.3 Effects of extraction temperature on TP yield

2.1.4 提取时间对荷叶多酚得率的影响 从图4中可以看出提取得率随提取时间延长而增加，在1h时得率基本上达到最大值，之后开始下降。这可能与缩合单宁（condensed tannins）进一步缩合、溶出蛋白质更多及金属盐离子发生了络合等化学反应有关，使测定值下降［16-18］。

图4 提取时间对多酚得率的影响Fig.4 Effects of extraction time on TP yield

表3 荷叶多酚提取正交实验设计与结果Table 3 Orthogonal experimental design and results for extraction TP from lotus leaf

2.2 荷叶多酚提取工艺优化

由单因素实验结果可知，提取温度、提取时间、液料比和乙醇浓度对荷叶多酚得率影响较大。由此可以采用4因素3水平的正交实验表进行正交实验。结果如表3所示。

表4 不同配方酒样的各指标含量和评分Table 4 Various indexes contents and ratings of different formula ofwine samples

从表3的正交结果可以得出，影响荷叶多酚提取的因素大小顺序为A＞D＞B＞C。即乙醇浓度对荷叶多酚提取得率的影响最大，温度对荷叶多酚提取得率的影响最小。从直观分析中可以看出最佳组合为A2B3C3D1。即乙醇浓度为50%，液料比为60∶1，提取温度为50℃，提取时间为50m in时，荷叶多酚的提取得率最高。

按表3所得出的最佳组合条件提取荷叶多酚。通过验证实验得出在最佳条件下多酚得率最高为9.01mg/g，且高于正交实验表中其他组合的多酚得率。

2.3 荷叶多酚黄酒的固形物含量与感官评定

总酸、氨基酸态氮、多酚、总糖、酒精度含量的测定结果见表4，国标规定半干黄酒的酒精度（20℃）（% vol）≥8.0，总酸（g/L）在2.5～7，氨基酸态氮（g/L）≥0.25，故所有样品均符合国家标准。总糖（g/L）在15.1～40，酒样中基酒与多酚比例为25∶3、50∶5这两配方酒样的总糖含量低于国家标准。同时从表中也可以看出十种配方的酒样其多酚含量都高于基酒的多酚含量。据文献［19］报道，红葡萄酒中含有大量多酚化合物，例如黄酮类、花青素、酚酸以及聚合物单宁。大多数这些化合物是红酒品质中最基本的成分，因为它们决定着酒的颜色、苦味、涩味、风味和抗氧化能力。而且适当地摄入多酚可以防止糖尿病和某些癌症。然而不同的葡萄酒中多酚的含量变化也很大，可能是由于不同的酿酒工艺造成的［20］，由此可见，在黄酒中添加荷叶多酚既可以达到保健的效果又可以改善黄酒的口感。

2.4 多酚等固形物对黄酒品质的贡献

表5 2个主成分的特征值和贡献率Table 5 Eigenvalues of 2 principal components and their contribution and cumulative contribution

将所得到的固形物含量与口感评分通过SPSS version 21统计软件进行主成分分析得到的结果如表5所示。

对测得的荷叶黄酒的理化指标与口感评分进行主成分分析，从表5中可以看出，前2个主成分的累积贡献率达80.199%，即表示前2个主成分已经包含原始数据80.199%的信息。且各配方黄酒的品质评价可由2个主成分表示，表达为原5个指标的加权组合，其线性组合如下式：

其中变量1～5分别为酒精含量、总酸、多酚含量、总糖、氨基酸氮。从以上模型可以看出，酒精含量、多酚、氨基酸态氮在第一主成分中起主要作用，第一主成分对总方差的贡献率为45.304%，总酸、总糖对第二主成分的影响显著，第二主成分对总方差的贡献率为34.894%。

由此可得回归方程为：Y=-2.705+0.696Z1-0.599Z2式（3）

由表6、表7可以看出，回归方程的方差分析达到极显著水平，表明回归方程的建立是有意义的。而入选的两个主成分对荷叶黄酒品质的决定回归系数达到R2=0.804属于高拟合度方程，说明建立的模型中所包含的2个变量因素能够解释建立模型80.4%的因变量变化，故拟合的方程在评价荷叶黄酒的品质中具有较好的参考价值。

表8是回归方程系数的显著性检验结果，回归方程入选的主成分Z1、Z2都达到了极显著水平。建立的回归方程为式（3），该方程校正后的回归系数达到R2=0.804，经回归方程的显著性检验F=21.571＞F0.01（p=0.001），因此该方程的建立是可靠的。故用荷叶黄酒的理化指标：总酸、氨基酸态氮、多酚、总糖、酒精度含量数据的第一主成分和第二主成分对荷叶黄酒品质进行预测是可行的。且由数据标准化处理后得到荷叶黄酒的口感评分并结合黄酒的国标得出其最佳配方为基酒与多酚比例为25∶5。

表6 回归方程的模型Table 6 Model summary of the regression equation

表7 线性回归方程的方差分析Table 7 Analysis of variance of linear regression equation

表8 回归方程系数的显著性检验Table 8 Significant test of the regression equation coefficients

3 结论

3.1 用正交实验优化荷叶多酚提取工艺，得最佳条件：乙醇浓度为50%，液料比为60∶1m L/g，提取温度为50℃，提取时间为50min时，荷叶多酚的提取得率最高为9.01mg/g。

3.2 对10种配方的荷叶黄酒的口感评分与理化指标的相关分析，并对这两者进行主成分回归分析，结果表明：酒精含量、多酚、氨基酸态氮在第一主成分中起主要作用，第一主成分对总方差的贡献率为45.304%，总酸、总糖对第二主成分的影响显著，第二主成分对总方差的贡献率为34.894%。

3.3 对荷叶黄酒的口感评分与入选的主成分建立回归方程，表明总酸、氨基酸态氮、多酚、总糖、酒精度的含量数据的第一主成分和第二主成分对荷叶黄酒品质进行预测是可行的。在一定程度上可以基于口感评分结果对荷叶黄酒的理化指标进行预测，从而为荷叶黄酒的配方和口感评估提供参考。

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Lotus leaf polyphenol extraction and application in rice wine

XU Hui-ling1，CAIW ei-rong1，*，CAO Tian-liang2，*，WANG W ei-shuang1
（1.College of Biological and Chemical Engineering，Anhui Polytechnic University，Wuhu 241000，China；2.Anhui Jinwo Agriculture Co.，Ltd.，Nanling 242400，China）

Optimization of extraction of polyphenols from lotus leaf to improve resource utilization and its applicationin rice wine. On the basis of single factor test，using the orthogonal test method on extraction time，solid-liquidratio ，extraction temperature and ethanol concentration extraction conditions were optimized. The resultsshowed that optimization of process was:the concentration of ethanol 50％ ，extraction time 50min，60 ∶1mL/gliquid material ratio，extraction temperature 50℃，lotus leaf polyphenol yield of 9.01mg/g. Lotus leaf polyphenolconcentrate was employed to prepare lotus leaf rice wine. The physicochemical indexes and taste rating ofdifferent formulations of lotus leaf rice wine was used to carry out the principal component analysis andstepwise regression analysis of SPSS software. The regression equation reached extremely significant level byanalysis of variance. It was feasible to predict the quality of lotus leaf rice wine. Finally，the optimum formulationof lotus leaf rice wine was that the ratio of base wine and polyphenols was 25∶5.

lotus leaf；polyphenols；extraction；lotus leaf rice wine；principal component analysis

TS262.4

B

1002-0306（2015）08-0277-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.049

2014－07－15

许惠玲（1990-），女，在读硕士研究生，研究方向：农产品深加工技术工程。

*通讯作者：蔡为荣（1963-），男，博士，教授，研究方向：天然产物功能因子。曹天亮（1970-），男，高级酿酒师，国家一级品酒师，研究方向：生物发酵、黄酒。

芜湖市科技局专利产业化专项（2013119）；安徽省大学生创新训练项目（201210363018）。