星点设计-效应面法优化肺衣抗氧化物质的超声辅助提取工艺

刘满红，刘晓芳，戴建辉，高云涛，王海龙

（1.云南民族大学化学与生物技术学院，云南省聚乳酸基功能材料工程实验室，云南昆明650500；2.云南民族大学，民族药资源化学国家民委－教育部重点实验室，云南昆明650500）

星点设计-效应面法优化肺衣抗氧化物质的超声辅助提取工艺

刘满红1，2，刘晓芳1，2，戴建辉1，2，高云涛1，2，王海龙1，2

（1.云南民族大学化学与生物技术学院，云南省聚乳酸基功能材料工程实验室，云南昆明650500；2.云南民族大学，民族药资源化学国家民委－教育部重点实验室，云南昆明650500）

利用超声波辅助提取法从肺衣中提取抗氧化物质，用星点设计-响应面法对提取工艺参数进行优化，采用DPPH自由基法检测提取物的清除自由基能力，基于单因素实验，以乙醇浓度、液固比、提取时间，做三因素五水平响应面优化，最佳工艺为：乙醇浓度为85.0%，液固比为18.6mL/g时，超声提取时间为20.0min，在此条件下对DPPH自由基清除率为91.69%，预测值为92.829%，与预测值偏差为-1.227%。星点设计-响应面法优化法是一种较好的实验设计方法。

肺衣，抗氧化活性，DPPH自由基，超声提取，响应面分析法

地衣（lichens）是植物界一个特殊类群，是真菌（fungi）和藻类（algae）高度结合的共生复合体，全世界约有地衣植物500余属，26000多种。它们分布极为广泛，从南北两极到赤道，从高山到平原，从森林到荒漠均有地衣植物的存在。地衣含有松萝酸、珠光酸、苔色酸等多种独特的次生代谢产物，具有多方面的生物活性［1］。近几年的文献报道从地衣植物中分离得到了许多具有活性的新化合物或新天然产物，而国内对地衣化学成分方面的研究已有一些报道［2-3］。而我国有丰富的地衣植物资源，尤其是在我国的西南地区，地衣植物在民间可以做药用和食用，云南肺衣（俗名青蛙皮）为地衣的一种，被大理白族视为纯天然山珍食品。

大量的科学实验证实，氧自由基与机体损伤有着非常密切的关系［4-5］，抗病性抗氧化能力与其抗逆性及延缓衰老密切相关。目前国内有对肺衣提取多酚［1-3］，国内外还未见到用苍山肺衣提取活性物质及抗氧化研究报道。本文将超声法与效应面分析法耦合提取植物中活性物质，并对抗氧化活性进行评价。超声波作为弹性介质中的一种机械波，具有操作简便快捷、能耗低、不破坏有效成分、提取效率高的特点［6］。本研究采用星点实验设计（central composite design，CCD），结合响应面分析法（RSM）［7］对抗氧化成分的提取工艺进行优化，CCD采用非线性数学模型拟合，用响应曲面法，以肺衣提取物对DPPH自由基的清除率为响应值对肺衣抗氧化成分的提取工艺进行优化，旨在得到最佳的抗氧化物质提取工艺条件，对开发具有天然抗氧化功能的产品，实现肺衣资源的综合利用具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

肺衣 购于云南大理，将肺衣洗净去除其他附属藻类植物，自然凉干，用粉碎机打碎成肺衣粉，封口袋密封保存；DPPH 美国Sigma A ldrich公司产品；其余所有试剂 均为分析纯。

AS10200AD型超声波清洗器 天津奥特赛恩斯仪器有限公司；9200型紫外-可见光分光光度计 北京瑞利分析仪器公司。

1.2 实验方法

1.2.1 超声波辅助肺衣抗氧化物提取工艺流程 肺衣粉→称重→石油醚→提取→滤渣干燥→一定浓度乙醇提取（超声波辅助）→过滤→取滤液定容检测抗氧化性。

1.2.2 DPPH贮备液的配制及标准曲线的绘制［8］准确称取DPPH试剂0.2530g于小烧杯中，用95%乙醇溶解，定量移入1000m L容量瓶中，用95%乙醇稀释至刻度，摇匀，得253.0mg/L DPPH贮备液，置于冰箱中冷藏备用。

准确移取10.0m L上述DPPH贮备液至100m L容量瓶中，用95%乙醇稀释至刻度，摇匀，得25.3mg/L DPPH标准溶液。用吸量管分别加入25.3mg/L的DPPH标准溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0m L和10.0m L于6个10m L容量瓶中，用95%乙醇稀释至刻度，摇匀，以95%的乙醇溶剂为参比，在波长517nm处测定各溶液的吸光度。以DPPH质量浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线，得线性回归方程为A=0.059C+ 0.0497，相关系数r=0.99935，在DPPH质量浓度为2.53～25.3mg/L范围内线性关系良好。

1.2.3 DPPH自由基法检测抗氧化活性［8-9］测定方法参考李姣娟［8］中的方法进行，将DPPH贮备液稀释至25.3mg/L，分别在5.00m L DPPH溶液中加入1.00m L的抗氧化剂溶液，总体积为6.00m L，混匀放置30m in后，用1cm比色皿于517nm处测定吸光度，根据DPPH标准曲线的回归方程计算DPPH质量浓度，并按下列公式计算DPPH·清除率。

式中：Co表示0时刻反应体系中DPPH的起始质量浓度，mg/L；Ct表示t时刻反应体系中DPPH的质量浓度，mg/L。

1.2.4 单因素实验 称取肺衣粉2.00g于锥形瓶中，加入20m L石油醚超声提取20m in后过滤（以除去肺衣自身颜色叶绿素和脂溶性成分），待滤渣在室温挥发干燥后将其移回锥形瓶中，根据不同的液固比加入溶剂，按照不同的条件（乙醇浓度、液固比、超声时间）进行超声波提取一次，提取后过滤，取滤液定容至50m L，研究不同条件提取物对DPPH自由基清除率的影响。

1.2.4.1 乙醇浓度的选择 固定液固比为15∶1、超声提取30m in，提取一次，乙醇浓度分别为50%、60%、70%、80%、90%（V/V），测定肺衣提取物对抗氧化活性的影响。

1.2.4.2 液固比的选择 固定乙醇浓度以75%（V/V）、超声提取30m in，提取一次，液固比分别为（m L/g）为（5∶1、8∶1、10∶1、12∶1、15∶1、20∶1），测定肺衣提取物对抗氧化活性的影响。

1.2.4.3 超声时间的选择 固定乙醇浓度以75%（V/ V）、液固比分别为（m L/g）为15∶1，提取一次，超声时间分别为10、20、30、40、50、60min，测定肺衣提取物对抗氧化活性的影响。

1.2.5 实验设计［10-11］根据单因素实验结果，以乙醇浓度（V/V%）、液固比（m L/g）和超声提取时间（m in）这三个因素为自变量，肺衣抗氧化活性为因变量，应用Design-Expert Software 7.16软件，进行三因素五水平星点设计实验，对实验结果进行多元线性回归和二项式拟合。因素水平见表1。

表1 星点设计因素水平编码表Table 1 Coded variables and their coded levels in CCD-response surface analysis

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 乙醇浓度对肺衣提取物抗氧化活性的影响由图1可知，DPPH·清除率随着乙醇浓度的先增大后减小，浓度在50%～70%有显著性差异，再增大浓度，没有显著性差异。肺衣中含有多酚和有机酸，不同的乙醇浓度具有不同的极性［12］，最佳乙醇浓度选择在75%～85%，后续实验中使用75%乙醇做溶剂。

2.1.2 液固比对肺衣提取物抗氧化活性的影响 由图2可知，DPPH自由基清除率随液固比的增大先增大后减小，从传质速率的角度讲，主要表现在影响固相主体和液相主体之间的浓度差，即传质推动力。液固比小，提取过程中液相浓度增加快，两相间的浓度差减少加快，从而使传质推动力衰减加快。其次，液固比的大小会影响两相的混合情况。尤其在搅拌不充分的情况下，会改变表观传质系数，从而影响传质速率。液固比的提高必然会在较大的程度上提高传质推动力，但也提高了生产成本及后续处理的难度，所以液固比也不宜太高［13］，15∶1时的DPPH自由基清除率有显著性差异。因此，液固比选择在15∶1比较合适。

图1 乙醇浓度对提取物抗氧化性的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on the antioxidant activity of extracts

图2 液固比对提取物抗氧化性的影响Fig.2 Effect of liquid solid ratio on the antioxidant activity of extracts

2.1.3 超声时间对提取物抗氧化活性的影响 由图3可知，DPPH自由基清除率随着超声时间的增加先增大后减小，超声波独具的物理特性能促使植物细胞组织破壁或变形，短时间内即可获得最佳提取率［14］，但超声时间过长，溶液温度较高，可能破坏了肺衣中抗氧化物质，清除率降低，因此超声时间控制在20min较为合适。

图3 超声波时间对提取物抗氧化性的影响Fig.3 Effect of ultrasonic time on the antioxidant activity of extracts

2.2 星点设计实验结果与分析

2.2.1 实验结果与模型拟合 根据中心组合设计原理，以乙醇浓度、液固比、超声时间三个因素为自变量A、B、C，提取物对DPPH自由基清除率为响应值，设计了共20个实验点的响应面分析实验，实验设计及结果见表2。

表2 星点设计响应面实验设计与结果Table 2 Experimental design and corresponding results for CCD-response surface analysis

本实验数据使用Design-Expert Software 7.16软件，采用星点设计分析方法，进行多元线性归和二项式拟合，对表2中的实验结果进行多元线性回归和二项式拟合，二次回归方程模型为：

对该回归方程进行方差分析（见表3），可以看出模型的p＜0.0001，说明该模型得到的回归方程是显著的，实验设计可靠，模型相关系数R2=0.9492，进一步说明模型具有较好的可信度。在所选取的各因素水平范围内，按照对结果的影响排序，乙醇浓度＞液固比＞超声时间。

从表3可以看出，方差分析的结果表明方程的总模型、乙醇浓度（A）、液固比（B）对DPPH自由基清除率的影响极显著；A2、B2、C2对DPPH自由基清除率的影响显著，而超声时间（C）、交互项AB、AC、BC对DPPH自由基清除率的影响不显著。

表3 星点设计-响应面实验结果方差分析表Table 3 Analysis variance for response CCD-surfacemodel

2.2.2 响应面分析 响应面方法（RSM）的图形是特定的响应值Y对应的因素构成的一个三维空间图，可以直观地反映各因素对响应值的影响，可直观的反映各实验因素的交互作用等［15-17］。

图4 肺衣抗氧化性物质提取条件优化的响应曲面图Fig.4 Response surface graphs for optimizing the extraction of antioxidants from Lobaria Pulmonariaon

由图4（a）和4（b）可知，随着乙醇浓度的增加，肺衣对DPPH自由基清除率升高，增大明显，乙醇浓度影响显著，由图4（a）和4（c）可知，随着液固比升高，对DPPH自由基清除率先增后降，液固比影响显著，从等高线可以看出，两因素的交互作用不显著。由图4（b）和4（c）可知，随着超声提取时间的增大，肺衣对DPPH自由基清除率先增大，当达到最大值后，再增加时间，清除率降低，超声提取时间影响不显著。

利用软件中的Optimization Choices模块的Point Prediction功能进行预测分析，获得一组响应值最大的优化条件：乙醇浓度为85.24%，液固比为18.6m L/g，超声时间为20.0m in，在此优化条件下，肺衣提取物对DPPH自由基清除率预测值为为92.8293%，参照理论上的优化条件进行验证实验，考虑到实际操作的可行性，条件修正为：乙醇浓度为85.0%，液固比为18.6m L/g，超声时间为20.0min，对DPPH自由基清除率实验值91.69%（n=5），与预测值的相对偏差为-1.227%。

3 结论

在单因素实验的基础上，采用RSM法优化了超声辅助提取肺衣抗氧化物质工艺参数，其肺衣提取物具有较好的抗氧化性，建立了回归模型方程，该模型回归极显著，说明该方程对实验拟合较好，得出了乙醇浓度和液固比是影响肺衣提取物清除DPPH自由基的抗氧化活性的主要因素，且无交互作用，超声时间影响不显著。同时也获得了该体系提取工艺参数：乙醇浓度为85.0%，液固比为18.6m L/g，超声时间为20.0m in，对DPPH自由基清除率实验值91.69%（n=5），与预测值基本相符，说明了用响应面分析法来设计最佳提取工艺的可靠性。超声波提取是一种节时、节能、节料的方法，能较好地应用于植物活性物质的提取，星点设计-响应面法优化法是一种较好的实验设计方法。

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Optimization of ultrasound-assisted extraction of antioxidants from Lobaria Pulmonaria by central composite design-response surface methodology

LIU M an-hong1，2，LIU Xiao-fang1，2，DAI Jian-hui1，2，GAO Yun-tao1，2，WANG Hai-long1，2
（1.The Engineering Laboratory of Polylactic Acid-Based Functional Materials of Yunnan，School of Chemistry and Biotechnology，Yunnan Minzu University，Kunming 650500，China；2.Key Laboratory of Chemistry in Ethnic Medicinal Resources，State Ethnic Affairs Commission&Ministry of Education，Yunnan University of Nationalities，Kunming 650500，China）

To optimize ultrasound-assisted extraction technology process condition of antioxidants from LobariaPulmonaria by central composite design -response surface methodology. For the evaluation of the ability ofextract to scavenge free radicals，a DPPH free radical system was constructed. Based on ethanol concentration，liquid to solid ratio，extraction time of single factor experiment，the principle of design for 3 star factor 5 fivelevel response surface methodology was applied. The ethanol concentration of 85.0％ ，liquid solid ratio of18.6mL/g，extraction time of 20.0min were selected as the optimum conditions. The extraction under theseconditions presented a DPPH radical scavenging ratio was 91.69％，with the theoretical 92.829％ for therelative error of -1.227％. Central Composite Design-response surface methodology was highly predictive inexperimental design.

Lobaria Pulmonaria；antioxidant activity；DPPH free radical；ultrasonic wave extraction；response surface analysis

TS201.1

B

1002-0306（2015）08-0240-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.042

2014－04－11

刘满红（1962-），女，硕士，教授，研究方向：物理化学教学与科研。

国家民委科研项目（12YNZ007）。